死活细胞的鉴定和显微镜直接计数
死活细胞的鉴定方法
活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。
细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。
在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。
死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。
染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以，在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
常用的方法包括染色法和仪器分析法。
1 染色法染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。
台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。
所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。
甲基蓝有类似的染色机理。
植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。
美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。
由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。
荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。
细胞死活鉴定 实验报告
细胞生物学实验报告细胞死活鉴定1.实验目的：观察上次实验培养的小鼠脾细胞，掌握细胞死活鉴定的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、血细胞鉴定板、盖玻片、胶头滴管、试管（2）实验药品：蒸馏水、台盼蓝染液、生理盐水、伊红染液（3）实验材料：小鼠脾细胞3.实验原理：（1）活细胞特征：细胞边缘清晰，细胞透明度高，整体立体感强，核区域明显，细胞质内颗粒物质较少，无空泡。
培养数天后，可观察到正在分裂的细胞。
（2）肉眼观察鉴定细胞死活：正常生长的细胞培养液微微发黄，透明度高；如发现培养液微混，则说明细胞量太大需进行传代培养，或者培养液被污染；如果培养液仍呈现清亮的粉红色，则说明细胞未生长。
（3）细胞凋亡特征过程：首先，细胞膜绒毛消失；然后，细胞收缩，细胞核高度浓缩，边缘化；最后，细胞核片段化，形成凋亡小体。
细胞核片段化时，如果对此类细胞进行DNA电泳，则会发现电泳条带呈梯状分布。
（4）细胞死活鉴定方法①染色排除法：细胞死亡后，细胞膜的通透性变大，染料可以通过细胞膜进入细胞。
因此，死细胞可以被染料染色，而活细胞由于细胞膜的选择透过性而呈无色。
②荧光染色法：活细胞需要进行代谢。
将荧光染料与有机分子结合（如二丙酸酯荧光素），使之易穿膜。
在活细胞中这些物质可被分解为荧光染料和有机分子（二丙酸酯和荧光素），在显微镜下观察，细胞被染色。
此种方法中，活细胞被染色，死细胞则呈无色。
（5）血细胞计数板的用法：如果是对比较密的细胞进行计数（如红细胞），则使用中间的中格进行计数，再将所得数值乘以2500，即是每毫升中的细胞数量；如果是对比较稀疏的细胞进行计数（如白细胞），则使用四个角上的大格进行计数，再将所得数值乘以10000，即是每毫升中的细胞数量。
4.实验步骤：（1）台盼蓝染色法：①用生理盐水制成0.4%的台盼蓝溶液备用②取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，加一滴染液，混合。
2 mins 后迅速制成临时装片，镜检。
（2）伊红丫染色法①用生理盐水制成0.15%的伊红染液混合② 2 mins 后制片镜检5.实验结果：视野中活细胞呈无色；死细胞呈蓝色，有些可观察到细胞核；还有少量细胞只有边缘部分呈蓝色。
细胞培养中死活细胞测定及细胞活力测定实验
细胞培养中死活细胞测定及细胞活力测定实验日期：2013-03-12 来源：未知标签：细胞活力测定摘要: 细胞培养过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。
染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。
这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。
细胞培养过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。
染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。
这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。
【实验原理】(一)染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要体现在：(1)死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
(2)死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。
常见的细胞染料有：中性红(细胞器的专有染料)、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯(FDA)等。
①中性红染色：常用染料之一，是细胞器的专有染料。
利用细胞膜的通透性差异，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。
中性红无毒，常做活体染色的染料。
②台盼蓝染色：当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。
③美蓝染色法：美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
动物细胞计数及存活率的测定
动物细胞计数及存活率的测定一、【实验目的】1、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。
2、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。
二、【实验原理】在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。
但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。
因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。
血球计数板血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。
H型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm血球计数板的计数室每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul）三、【实验仪器与试剂】仪器与器材：显微镜、血球计数板、吸管、培养皿、试管、软布或擦镜子试剂：0.4%台酚蓝染液，生理盐水，酒精四、【实验步骤】细胞死活的鉴定及计数1、用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。
把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。
2、取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。
如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。
3、向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间的空隙。
4、显微镜下观察和计数，活细胞不着色，死细胞被染上蓝色。
5、分别统计角上的4个大方格内的活细胞和死细胞数，两个平台共8个大方格。
计算公式活（死）细胞数（个/ml）=8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ⨯104⨯稀释倍数细胞存活率%=（活细胞数/细胞总数）⨯%五、【实验结果及讨论】通过观察实验结果如下1、活（死）细胞数（个/ml）=8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ⨯104⨯稀释倍数=60/8 ⨯104⨯1=780（个）------------未经稀释处理2、细胞存活率%=（活细胞数/细胞总数）⨯100%=60/90⨯100%血球计数板方格活细胞死细胞=66.67%图中，空心圆圈代表未被染色的透明活细胞，实心圆圈代表被染色的死细胞。
台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理
台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。
台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。
健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。
依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。
染色原理:正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。
台盼蓝拒染法台盼蓝拒染法是利用台盼蓝只能将死细胞染成蓝色而活细胞不能被染上的方法检测细胞存活率的一种快速简便的方法。
染色原理:正常细胞具有完整的细胞膜结构，而死亡的细胞其细胞膜结构被破坏。
台盼蓝无法通过正常的细胞膜因而正常的细胞不被台盼蓝染上，而死细胞则可被台盼蓝染成蓝色。
流程:（1）将对数生长期的细胞浓度调整为1~10×10细胞/ml，按10~10个细胞接种于96孔板，每孔100 μl；（2）培养细胞24小时后，对其进行不同处理，每个处理设三个平行对照；（3）收集细胞，经台盼蓝染色，在倒置显微镜下计数蓝染及不染色细胞，计算细胞存活率；（4）结果统计：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。
根据下式求细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100注意事项:台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。
否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。
科研试剂，广泛应用于分子生物学，药理学等科研方面，严禁用于人体。
本品为生物染色剂，在细胞毒性试验中用于检测死亡细胞和垂死细胞，也可用于细胞活性的常规评估。
如病毒检验，注入循环系统可使肾小管着色，哺乳动物、低等脊椎动物和昆虫的各种组织活体染色。
酵母菌形态的观察和显微镜直接计数法_OK
2
实验原理
❖美兰染色检测酵母菌死活细胞的原理：
▪ 美兰在氧化态时为蓝色，在还原态时为无色。活的 酵母细胞具有还原能力，能使美兰保持为还原态， 因此染色后死的为蓝色、活的为无色。
❖酵母菌细胞计数的原理:
▪ 将菌液放在已知体积计数室(1mm2×0.1mm)，计数 室薄，因此每个细胞都可以被看到。体积确定，因 此数完所20有06/0细2 胞后就知道单沈位阳广体众积的细胞个数。3
• 3. 将玻片放置约3分钟后镜检，先用低倍镜观察 后用高200倍6/02镜观察酵母菌的沈形阳广态众 ，并根据颜色区4别 死活细胞。
三.实验步骤:
•
作业
画图说明你所观察到的酵母菌的形态特征，并说明死细胞和活细胞分别为什么颜色。
2006/02
沈阳广众
5
三.实验步骤:
二．显微镜直接计数法
• 1. 菌悬液的制备：以无菌水将酿酒酵母制成浓度适 中的菌悬液
• 2. 镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进 行镜检，若有污物，则需清洗，吹干后才能计数。
• 3. 加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片， 再用无菌滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小 滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室， 一般计数室均能充满菌液。
• 注意：取2006样/02 时先要摇匀菌液沈；阳广加众 样时计数室不可6 有 气泡产生。
三.实验步骤:
二．显微镜直接计数法 • 4. 显微镜计数：加样后静止5分钟，然后将血球计数板置
于显微镜下，先用低倍镜找到计数室，再用高倍镜进行 计数。 • 在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度再 计数。一般样品稀释度要求每个中格内15-20个菌体为宜。 每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格） 中的菌液进行计数。 • 注：位于格上的菌体一般只数上方和右边线上的（计上 不计下2，006/计02 右不计左）。若遇沈酵阳广母众出芽，芽体大小与母7 细胞一样大时，即作为两个菌体计算。
实验七酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数法
通过血球计数板对酵母菌进行计数，我们得到了每毫升菌 液中酵母菌的数量。结果显示，菌液中酵母菌的数量在合 理范围内，计数结果准确可靠。
对实验过程的反思与总结
实验操作方面
在实验过程中，我们需要注意无菌操作 ，避免杂菌污染。同时，需要准确配制 试剂，保证实验结果的准确性。
VS
实验设计方面
在实验设计时，需要考虑实验的可行性和 可重复性。本实验中，血球计数法的操作 较为简便，且结果准确可靠，是一种有效 的计数方法。
死活细胞鉴定结果分析
死活细胞鉴定结果
通过染色法和荧光染色法，我们成功地对酵母菌的死活细胞进行了鉴定。活细胞能够吸 收染料并发出荧光，而死细胞则不能。在显微镜下观察，活细胞呈现明显的荧光，而死
细胞则无荧光。
分析
死活细胞鉴定结果表明，大部分酵母菌为活细胞，仅有少量酵母菌为死细胞。这说明在 实验过程中，酵母菌的生长条件较为适宜，且培养基的营养成分能够满足酵母菌生长的
实验七酵母菌的形 态观察、死活细胞 鉴定及血球计数法
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握酵母菌的形态观察方法
了解酵母菌的形态特征
通过显微镜观察，了解酵母菌的单细 胞形态，包括其形状、大小、细胞壁 、细胞膜等结构特点。
学习染色法
THANKS
感谢观看
酵母菌是单细胞真菌，通常呈卵圆形或圆柱形，具有细胞壁、细胞膜、细胞质和 细胞核等基本结构。通过显微镜观察酵母菌的形态，可以了解其生长状态和繁殖 方式。
酵母菌在生长过程中，会经历由单倍体到二倍体的过程，通过观察其形态变化， 可以了解其生长周期和繁殖特点。
死活细胞的鉴定方法
死活细胞的鉴定方法活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。
细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。
在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。
死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。
染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以, 在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
常用的方法包括染色法和仪器分析法。
1染色法染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。
台盼蓝, 又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。
所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。
甲基蓝有类似的染色机理。
植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。
美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。
由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。
荧光素双醋酸酯（FDA是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体FDA本的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：身不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。
酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微直接计数法
酵母菌地形态观察及死活鉴别与显微直接计数法酵母菌地形态观察及死活鉴别与显微镜直接计数法I 酵母菌地形态观察及死活鉴别一、目地要求观察酵母菌地细胞形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞地实验方法.二、基本原理酵母菌是多形地、不运动地单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显地分化，菌体比细菌大.繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；地.0.1(1)(2)泡.(3)(1)II1．明确显微镜计数地原理.2．学习使用血球计数板进行微生物计数地方法.二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用地微生物计数方法.此法地优点是直观、快速.将经过适当稀释地菌悬液(或孢子悬液)放在血球计数板载玻片与盖玻片之间地计数室中，在显微镜F进行计数.由于计数室地容积是一定地(0.1mm3)，所以可以根据在显微镜下观察到地微生物数目来换算成单位体积内地微生物总数目.由于此法计得地是活菌体和死菌体地总和，故又称为总菌计数法.血球计数板，通常是一块特制地载玻片，其上由四条槽构成三个平台.中间地平台又被一短横槽隔成两半，每一边地平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间地大方格即为计数室，微生物地计数就在计数室中进行.计数室地刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格.；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格..但无论是哪种规格地计数板，每一个大方格中地小方格数都是相同地，即16 X 25：400小方格.每一个大方格边长为1mm，则每一大方格地面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间地高度为0.1mm，所以计数室地容积为0.1mm3.25，因B (个1ml1234静止.一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜.每个计数室选5个中格(可选4个角和中央地中格)中地菌体进行计数.位于格线上地菌体一般只数上方和右边线上地.如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞地一半时，即作两个菌体计数.计数一个样品要从两个计数室中计得地值来计算样品地含菌量.5．清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干.镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物.若不干净，则必须重复洗涤至干净为止.五、实验报告1．结果将结果记录于下表中.A表示五个中方格中地总菌数；B表示菌液稀释倍数.2．思考题根据你实验地体会，说明用血球计数板计数地误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差，力求准确？。
实验五 酵母菌的形态观察、死活细胞的鉴别及显微镜直接计数法
五、实验报告
1、绘图说明你所观察的酵母菌的形态特征 填表： 2、填表：
各中格中菌数 1 2 3 4 5 二次平均值 菌数/mlAຫໍສະໝຸດ B 5二、实验原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物， 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见 细菌大几倍甚至十几倍。大多酵母菌以出芽方式进行无性繁殖， 细菌大几倍甚至十几倍。大多酵母菌以出芽方式进行无性繁殖， 有的分裂繁殖，有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。 有的分裂繁殖，有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通 过美蓝染液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方式。 过美蓝染液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方式。
菌种： 1、菌种：酿酒酵母 仪器或其他用品：血细胞计数板，显微镜， 2、仪器或其他用品：血细胞计数板，显微镜，盖玻 片，载玻片等 0.1%美蓝染色液等 3、0.1%美蓝染色液等
四、实验内容： 实验内容：
1、美蓝浸片观察 在载玻片中央加一滴0.1%的美蓝染色液， 在载玻片中央加一滴0.1%的美蓝染色液，然后用 0.1%的美蓝染色液 接种环取少量酵母菌于染液中，混合均匀； 接种环取少量酵母菌于染液中，混合均匀； 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触， 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然 后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上。 后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上。将玻片放置 约三分钟后，用显微镜观察酵母的形态和出芽情况， 约三分钟后，用显微镜观察酵母的形态和出芽情况， 并判断细胞的死活。 并判断细胞的死活。
利用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生 物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片， 物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构 成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半， 成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边 的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为几个大方格， 的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为几个大方格， 中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图1 中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图1，计数室的 刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而 刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格， 25个中方格 每个中方格又分成16个小方格，另一种是一个大方格分成16 16个小方格 16个 每个中方格又分成16个小方格，另一种是一个大方格分成16个 中方格，而每个中方格又分成25个小方格， 25个小方格 中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规 格的计数板，每一个大方格中的小方格400 400个 格的计数板，每一个大方格中的小方格400个，每一个大方格 边长为1毫米，则每一个大方格的面积为1mm 盖上盖玻片后， 边长为1毫米，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后， 盖玻片与载玻片之间的高度为0.1毫米， 0.1毫米 盖玻片与载玻片之间的高度为0.1毫米，所以计数室的容积为 万分之一毫升）。 0.1mm3（万分之一毫升）。
微生物显微镜直接计数法和死活细胞的鉴定[总结]
![微生物显微镜直接计数法和死活细胞的鉴定[总结]](https://img.taocdn.com/s3/m/6b47616e02d276a201292e66.png)
微生物显微镜直接计数法和死活细胞的鉴定[总结] 实验四微生物显微镜直接计数法和死活细胞的鉴定以及四大类微生物菌落形态的比较和识别微生物显微镜直接计数法一、实验目的1、学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。
2、学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。
二、实验原理酵母菌显微直接计数—血球计数板三、实验材料显微镜、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、吸水纸、擦镜纸.四、实验步骤1、取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。
2、取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。
3、用10×(40x)镜观察并将计数室移至视野中央。
4、在10×(40x)镜下计数:计数5个中格的平均值，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。
注意事项:计上不计下，计左不计右。
出芽计一半。
五、实验结果将显微计数结果记录于下表中。
T表示五个中方格中的总菌数。
各中格中菌数二室平个/ml T均值 1 2 3 4 5第一室第二室六、问题与讨论在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点,有何改进方法,酵母菌死活细胞的鉴定一、实验原理美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。
因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。
二、实验材料酵母菌悬液、 0.1 ,吕氏碱性美蓝染色液显微镜、载玻片、盖玻片。
三、实验步骤美蓝镜片的观察1)在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用吸取计数时酵母菌样品液放在染液中，混合均匀。
2)用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。
3)将制片放置约1min后镜检，低倍镜到高倍镜观察，根据颜色来区别死活细胞。
对于死细胞和活细胞的检测
对于死细胞和活细胞的检测细胞检测是现代生命科学中一项重要的研究技术，它能够帮助科学家们更好地理解细胞的结构和功能。
在细胞检测中，对于死细胞和活细胞的区分是一项关键任务。
本文将介绍几种常用的方法和技术，用于死细胞和活细胞的检测。
一、显微镜观察法显微镜观察法是最常见和直观的方法之一。
通过光学显微镜或荧光显微镜观察细胞样本，死细胞和活细胞通常会显示出不同的形态和特征。
1. 死细胞：死亡的细胞通常会失去原有的形态结构，细胞膜会发生透明化，并且细胞内部结构会发生溶解或崩解。
在显微镜下观察，死细胞通常呈现出淡颜色或无颜色，失去了细胞的活力。
2. 活细胞：活细胞具有完整的形态结构，细胞膜完整无缺，并且细胞内部结构可见。
在显微镜下观察，活细胞通常呈现出鲜艳的颜色，细胞具有明显的活力。
显微镜观察法的优点是简单易行，但它无法量化细胞的存活率和死亡情况，只能提供对细胞状态的直观判断。
二、细胞染色法细胞染色法是一种常用的细胞检测方法，通过染色剂与细胞特定的成分或结构发生特异性反应，从而实现死细胞和活细胞的区分。
1. 年龄染色剂：细胞死亡后，其细胞膜通透性增加，可以用某些染色剂直接渗透到细胞内部，如乙锭和丙硫菌素等。
死细胞会呈现出亮绿色或亮红色，而活细胞则不会显颜色。
2. 细胞膜染色剂：细胞膜染色剂可与活细胞膜结合，形成可观察的颜色变化。
荧光染料如胶体金和荧光素-912等在活细胞中会表现出荧光信号，而在死细胞中没有或明显减弱。
细胞染色法具有较高的特异性和灵敏度，可以在显微镜下观察到细胞的染色情况，但它对于染色剂选择和操作技术要求较高。
三、流式细胞术流式细胞术是一种高通量的细胞检测方法，利用流式细胞仪对细胞进行快速和准确的分析。
1. 染色法：流式细胞仪通常配备多种不同的细胞染色试剂，如细胞膜染色剂、活细胞假染剂和核酸染色剂等。
通过选择适当的染色方法，可以将死细胞和活细胞准确地区分开来。
2. 四象限图法：流式细胞仪利用四象限图法，将细胞根据细胞膜与核酸染色的属性进行分类。
动物细胞的死活鉴定和存活率的测定
（二）、动物细胞的死活鉴定和存活率的测定一、实验目的及原理1、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。
2、学习用血球计数板进行细胞计数，以测定动物细胞存活率的方法。
原理：在显微镜下，从形态上很难区分死、活细胞。
但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。
因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。
二、实验材料试剂血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、电吹风、0.25%胰蛋白酶液、PE液、MEM+小牛血清培养液、0.4%台盼蓝三、主要操作步骤（一）细胞悬液的准备1、75%酒精棉球消毒双手、工作台面、培养瓶和试管等。
2、将前一实验传代培养的细胞培养液倒入一个小试管中，暂存。
3、向培养瓶内加入5ml PE液，平放轻摇，放置2～5分钟后倒掉。
4、向培养瓶内加入0.5～o.8ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放置2～４分钟后倒掉。
拍打悬浮后，再将暂存的细胞培养液倒入，制备成单细胞悬液, （内含活细胞和死细胞）。
（二）细胞死活鉴定及计数1、用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。
把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。
2、取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。
如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。
3、向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间的空隙。
4、显微镜下观察和计数。
活细胞不着色，死细胞被染上蓝色。
分别统计角上的4个大方格内的活细胞和死细胞数，两个平台共8个大方格。
（三）数据的统计活（死）细胞数（个/ml）=8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ⨯104⨯稀释倍数细胞存活率%=（活细胞数/细胞总数）⨯%四、实验结果第一个平台，四个角的活细胞数分别为9,10,7,12；死细胞数分别为2,2,3,1.第二个平台，四个角的活细胞数分别为11,7,9，10；死细胞数分别为3,2,2,2.五、思考题解答与讨论计算培养瓶中活（死）细胞数（个/ml），计算细胞存活率%。
台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理
台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理
原理：活细胞不会被台盼蓝染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。
正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，这与中性红作用相反。
因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。
台盼蓝是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。
注意凋亡小体也有台盼蓝拒染现象。
台盼蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。
扩展资料
台盼蓝染色步骤：
1、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。
使用时。
用PBS稀释至0.4%。
2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。
3、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。
（终浓度0.04%）
4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%
台盼蓝染色只需3-5分钟即可完成，并且操作非常简单。
2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，台盼蓝在2B类致癌物清单中。
死细胞与活细胞的显微判别、活细胞计数
死细胞与活细胞的显微判别、活细胞计数（一）健康细胞与年轻死亡细胞的观看健康即是所谓的活细胞。
在显微镜视场下，健康细胞的形态表现为细胞匀质光明，透亮度大，折光性强。
相差显微镜的视场下，可以看清细胞的形态结构，细胞质中有粗壮的线粒体颗粒和细胞核。
细胞术语中，死细胞普通指年轻细胞和死亡细胞的总称。
另外，相对于正常细胞大小两倍以上或1/2以下的细胞分离称作“大细胞”或“小细胞”。
“大细胞”可以理解为多个细胞融合形成的暂时细胞，或细胞经受核分裂但未能完成细胞质分裂的那些细胞，这些细胞不能正常分裂，故属于死细胞。
“小细胞”普通是因为培养环境或培养液含有细胞凋亡因素，由细胞凋亡形成的规章小膜泡。
1．微量移液器的结构及其用法通常需要用法微量移液器的辅助才干将细胞培养物的单细胞悬液预备好，以便在显微镜下观看细胞的形态特征。
对微量移液器的结构了解是十分须要的（图9-5)。
用法时，微量移液器的操作手势和取吸嘴动作要领也有一定的规范，详细参考指导老师的现场示范动作。
用法时，所取液体不行接触移液器吸嘴衔接部。
移液器调整刻度至最大量程以免影响移液器的精密度，存放时应立放于指定位置。
2．台盼蓝染色法用微量移液器定量移取单细胞悬液，另取0.4％台盼蓝染液与细胞悬液按1：1比例混匀。
然后滴加到整洁的载玻片上，加盖玻片使成单层细胞悬液。
染色3-5min后，在l00×显微视场下观看。
死细胞和细胞碎片均被染成蓝色，活细胞则不着色。
此种办法应用比较广泛，技术难度相对较小。
但需注重，有些异样大小的、不着色的细胞不一定是活细胞，如“大细胞”和“小细胞”。
3．显微形态挺直判别用微量移液器定量移取单细胞悬液，滴加到整洁的载玻片上，加盖玻片使成单层细胞悬液。
这种办法判别死活细胞有一定的技术难度，需要经过训练才干逐步掌握。
(1)延续变焦细胞形态观看在100×-400×显微视场下往复变焦观看。
死细胞和细胞碎片的轮廓欠圆润，甚至不延续，细胞或碎片持续发亮的行程比较短。
03-03-006任务单-酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数
任务单
子情景：活性干酵母发酵过程检验—酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数
一、实训目标学习活性干酵母发酵过程中酵母细胞的检测方法，掌握活死
酵母菌细胞的鉴别以及使用血球计数板计数
二、使用器材及药品药品：美兰染色液
器材：光学显微镜，血球计数板
三、实训内容1、发酵液中酵母细胞的稀释方法
2、酵母菌美兰染色方法
3、光学显微镜的使用
4、使用血球计数板统计酵母菌的数目
四、实训要求1、阅读引导文完成引导问题
2、酵母菌死活细胞鉴别
3、利用血球计数板计数
4、将实训内容进行总结、分析，写出实训报告。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
死活细胞的鉴定和显微镜直接计数
学院：生命科学专业：生物科学年级：2010级姓名：王亚军
指导老师：张琪白璐陈勇
摘要：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。
其细胞的大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。
大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。
通过美蓝染液水浸片和水—碘液水浸片可在显微镜下观察到啤酒酵母的形态和出芽生殖方式。
用美蓝对啤酒酵母的活细胞进行染色，可对啤酒酵母的死细胞和活细胞进行鉴别。
测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法等。
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载片上，在显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
关键词：啤酒酵母菌美蓝染料血细胞计数板
引言：酵母菌的繁殖方式包括无性繁殖和有性繁殖。
无性繁殖方式包括芽殖和裂殖。
芽殖是酵母菌最普遍的繁殖方式。
其过程是：成熟的母细胞在其形成芽体的部位长出芽细胞，芽细胞脱离母体，成为新的个体细胞。
如果不脱离母细胞，又长出新芽，子细胞就和母细胞连接在一起，形成藕节状或竹节状的细胞串，称为假菌丝或真菌丝。
少数酵母以裂殖方式进行繁殖，当母细胞长到一定大小时，细胞核开始分裂，之后，在细胞中间产生一隔膜，将细胞一分为二。
还有些酵母菌可形成一些无性孢子如节孢子、掷孢子、厚垣孢子等。
有性繁殖则是通过形成子囊和子囊孢子。
常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母菌、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。
其中用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。
实验内容：
实验原理：
美兰是一种无毒性染液，有两种形态还原型：无色氧化型：蓝色。
活细胞因新陈代谢而有强还原力，使美兰从氧化型变为还原型；死细胞无此能力，而被美兰染成蓝色。
以此可以区分死活细胞。
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽构成3个平台.中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。
计数区的刻度有两种：一种是25×16：计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是16×25：一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。
技术时，通常数五个中方个的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格中德总菌数，再换算成一毫升菌液中的总菌数。
实验材料
1.菌种：啤酒酵母
2.染色液：0.1%吕氏碱性美蓝
3.器材：载玻片，显微镜、血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
三、实验步骤
（一）酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定
1、在载玻片上各滴加一滴染色液和酵母菌培养液，盖上盖玻片，（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片）
2、将制好的水浸片放置2分钟后镜检。
先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。
3、染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。
4、染色一小时后，再观察一下死细胞数是否增加。
（二）、显微镜直接计数法
1.镜检计数室，熟悉计数器的使用方法
2.对稀释5倍的啤酒酵母悬液进行计数
3.注意：
（1）血球计数板必须洗干净，勿刷
（2）注意勿损坏计数器
计数原则：
1、稀释浓度要合适，每个小方格5-10个酵母菌
2、压线的酵母菌，一般计上和右
3、对于出芽的菌体，如果芽体超过母体的一半，算2个菌
实验结果：在四十倍的显微镜下可看到啤酒酵母菌呈单个的椭球形细胞，以出芽的形式进行无性繁殖，其芽体和母体连在一起。
还可看到，有的酵母菌呈蓝色，为死细菌，有的酵母菌呈无色，为活细菌，并且随着时间的推移，死细菌在增多。
参考文献：
微生物学实验（第三版）沈萍范秀容李广武主编
微生物学实验讲义张琪
2011年10月7
日。