酶法分析
酶学分析技术范文
酶学分析技术范文酶学分析技术（Enzyme Assay Techniques）是一种用于测定生物样品中酶活性的方法。
酶是生物体内广泛存在的催化剂，可以加速化学反应的速率。
酶学分析技术在生物化学、医学、农业等领域都有重要的应用。
首先，酶学分析技术中最常用的方法之一是光度法。
光度法基于酶催化反应产生物质的颜色变化，并通过测量吸光度来确定酶活性的方法。
典型的酶学分析技术中，一种常用的测量指标是酶促反应后产生的NADH或NADPH的浓度。
通过比较反应前后的吸光度差异，可以计算出酶的催化速率。
其次，酶学分析技术中常用的另一种方法是荧光法。
荧光法基于酶催化反应后产生荧光分子的原理，通过测量荧光信号来确定酶活性的方法。
荧光法具有高灵敏度和高选择性的特点，适用于检测低浓度的酶活性。
常用的荧光剂包括荧光底物和荧光探针，可以通过酶催化反应后的荧光信号强度或颜色变化来确定酶活性。
此外，酶学分析技术中还有其他一些常用的方法，例如比色法、电化学法和质谱法等。
比色法通过测量反应物质的颜色变化来确定酶活性，常用的比色剂有碘化钠、邻联二硝基苯胺等。
电化学法基于酶催化反应过程中产生的电流变化来确定酶活性，常用的电极包括氧化还原电极、工作电极和对比电极等。
质谱法利用质谱仪分析酶催化反应产物的质荷比来确定酶活性，可以用于分析复杂的代谢途径和检测微量物质。
总的来说，酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中有着广泛的应用。
通过研究酶的活性和底物/产物之间的关系，可以了解酶的催化机制和生理功能。
酶学分析技术不仅可以用于检测酶的活性、底物和产物的含量，还可以用于筛选和优化酶的性质，例如通过变异酶突变、构建重组酶等方法。
此外，酶学分析技术还可以用于药物研发、生物工程和环境监测等领域。
总结起来，酶学分析技术是一种用于测定生物样品中酶活性的重要方法。
其原理和实验步骤多种多样，常用的方法包括光度法、荧光法、比色法、电化学法和质谱法等。
酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中具有广泛的应用，可以了解酶的催化机制、优化酶的性质，以及在药物研发、生物工程和环境监测等领域中的应用。
代谢物酶法分析技术
采用统计学、机器学习等方法对处理后的数据进行深入分析，挖 掘代谢物与生物体生理状态之间的关联。
结果可视化
将分析结果以图表、图像等形式进行可视化展示，便于理解和解 释。
03
代谢物酶法分析技
术实验设计
实验材料准备
酶
选择特异性针对目标代谢物的酶，确 保酶的纯度和活性。
底物
准备目标代谢物的标准品和待测样品， 确保样品的纯度和浓度。
酶与底物的结合
酶具有特异性，能够与特定的底物结合形成酶底物复合物，从而引发催化反应。
3
酶催化反应的动力学
酶催化反应遵循米氏方程，反应速率受底物浓度、 酶浓度、温度、pH等因素的影响。
代谢物检测原理
代谢物的提取与纯化
从生物样本中提取代谢物，并通过适当的纯化方法去除干扰物质， 提高检测的准确性和灵敏度。
06
代谢物酶法分析技
术未来发展趋势
技术创新方向
高通量分析技术
随着生物技术的发展，未来代谢物酶法分析技术将更加注 重高通量、高灵敏度和高准确性的分析方法开发，以满足 大规模样本分析的需求。
多组学整合分析
代谢物酶法分析技术将与基因组学、蛋白质组学等多组学 技术进行整合，以全面解析生物体的代谢调控网络。
结果解读
结合实验目的和背景知识，对实验结果进行解读和分析，探讨代谢 物与酶活性之间的关系以及可能的影响因素。
04
代谢物酶法分析技
术应用实例
生物医学领域应用
疾病诊断
通过对体液（如血液、 尿液）中特定代谢物的 酶法分析，可以辅助诊 断某些疾病，如糖尿病、 肝病等。
药物研发
利用代谢物酶法分析技 术，可以研究药物在体 内的代谢途径和代谢产 物，为新药研发提供重 要依据。
8酶法分析
下图是根据反应前后酶反应体系的吸光度或荧光 强度的总变化，测定产物（或底物）的量。 （1） CA、CB和CC 3个底物浓度对吸光度 变化的影响，吸光度最 初变化快，以致反应在 几分钟内即可完成。此 方法仅需知道最初和最 终吸光度； （2）根据（1）中的数 据，得到底物浓度和吸 光度总变化的相关图
终点法的优点
•
该法的原理是
SOD亚硫酸 盐氧化酶
存84天。
通过酶反应循环系统的高 灵敏度测定法
8.2.2
A＋B C＋D A＋Y C＋X • 如果待测底物Ａ的量极微，无法直接测定时，可 将以上两式偶联，构成一个酶反应循环系统，将 Ａ的产物Ｃ再变成Ａ，如此经过多次循环，产物 Ｄ的量将随反应时间不断积累而增多；如果选择 适当的反应条件，在一定时间后使循环反应停止 时，Ｄ的生成量将与被测物质Ａ的最初浓度成比 例。对于不能直接测量的微量物质Ａ，经过循环 反应后，通过测量Ｄ就能定量微量的Ａ。
（4）选用乙酸萘酯作为底物
• a-乙酸萘酯＋水
胆碱酯酶 有机磷农药
萘酚＋乙酸 固蓝B 显色产物
• 在680nm波长处测定吸光度。检出限在 mg/kg级别。不可检出氨基甲酸酯类农药。
酶法分析技术的种
类及其基本原理
龙肇. 马硕
8.2 酶法分析技术
8.2.1 多酶偶联测定法 8.2.2 通过酶反应循环系统的高灵敏度测定法 8.2.3 放射性同位素测定法 8.2.4 酶标免疫检测法 8.2.5 酶联免疫吸附检测法
食品酶学分析中采用终点法所需 要的某些酶的浓度
底物 葡萄糖 甘油 尿酸 延胡索酸 酶 已糖激酶 甘油激酶 尿酸氧化酶 延胡索酸酶 Km 1.0×10-4(30℃) 5.0×10-5(25℃) 1.7×10-5(20℃) 1.7×10-6(21℃) 酶浓度 /(IU/L) 1.67 0.83 0.28 0.03
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术代谢物酶法分析技术的基本原理是利用目标代谢物与特定酶之间的底物-酶-产物反应，通过测定底物的消耗或产物的生成来间接地推测出代谢物的浓度。
通常来说，该方法需要有一个特异性高、反应速率快且稳定的酶作为标志物，该酶只与特定的代谢物发生催化反应。
1.选择合适的酶和底物：酶的选择应取决于需要分析的代谢物。
确保所选的酶对分析样品中的干扰物不敏感，并且酶底物与其他代谢物之间没有交叉反应。
2.校准测定：为了确定测定所需的最佳反应条件，可以通过在不同酶底物浓度下进行一系列试验来建立标准曲线。
标准曲线可以反映酶催化反应速率与底物浓度之间的关系。
3.准备样品：根据需要，对样品进行前处理，如去除干扰物或质量校正。
4.反应体系：将样品与合适的酶底物混合，在适当的反应条件下孵育一定时间，以使酶反应发生。
这个反应体系可以是液体相或固相。
5.检测和测量：将反应体系中的代谢物与其他物质分离，并使用合适的测量仪器和方法测定其浓度。
常用的测量方法包括：比色法、荧光法、放射性测量法等。
1.高灵敏度：代谢物酶法具有高灵敏度，能够检测到非常低浓度的代谢物。
2.特异性：选择特异性酶和底物可以避免其他代谢物的干扰。
3.快速：酶催化反应速率快，在短时间内可以得到准确的测量结果。
4.稳定性：酶底物具有较高的稳定性，可以长时间保存并重复使用。
代谢物酶法分析技术的应用非常广泛。
在医学领域，代谢物酶法可以用于检测血液中的生化指标，如葡萄糖、胆固醇等，用于疾病的早期诊断和监测。
在食品科学领域，代谢物酶法可以用于检测食品中的营养成分，如脂肪、蛋白质等，用于食品质量的评估和控制。
此外，代谢物酶法还可以用于监测环境污染物和化学物质的代谢产物，用于环境和毒理学研究。
总之，代谢物酶法分析技术是一种快速、灵敏、特异性高的代谢物测定方法，具有广泛的应用前景。
通过选择合适的酶和底物，并采取适当的测量方法，可以有效地分析各种生物体中的代谢物。
酶法分析的基本原理与应用
酶法分析的基本原理与应用1. 酶法分析的基本原理酶法分析是一种通过酶的催化活性来测定样品中特定物质含量的方法。
它基于酶与底物之间的专一性结合和催化活性，利用底物的转化率与被测物质的含量成正比的原理进行分析。
其基本原理包括以下几个方面：•酶的选择性：酶具有高度的选择性，只能催化特定的底物转化为特定的产物。
通过选择适当的酶，可以实现对目标物质的特异性分析。
•底物浓度与酶催化率的线性关系：酶活性与底物浓度呈线性关系。
当底物浓度较低时，酶的催化率与底物浓度成正比；而当底物浓度较高时，酶的催化率可能会达到饱和状态。
•酶催化反应速率的测定：酶催化反应速率可以通过测定底物消失速度、产物生成速度或酶底物复合物的稳定性等指标来确定有关酶催化反应的动力学参数。
2. 酶法分析的应用酶法分析由于其高度的选择性、灵敏度和准确性，被广泛应用于许多生物医学、食品安全和环境监测领域。
以下是酶法分析的几个主要应用：2.1 生物医学领域酶法分析在生物医学领域中有着重要的应用。
它常被用于检测血液、尿液和其他生物体液中的生化指标，如葡萄糖、胆固醇、尿素等。
通过检测这些指标的变化，可以评估人体的健康状况和疾病风险。
2.2 食品安全领域酶法分析在食品安全领域中也有广泛的应用。
例如，通过检测食品中的转基因成分、防腐剂和重金属等有害物质，可以确保食品的质量和安全性。
同时，酶法分析还可以用于检测食品中的营养成分，以评估食品的营养价值。
2.3 环境监测领域在环境监测领域，酶法分析被广泛应用于水污染、空气污染和土壤污染等环境问题的监测。
通过测定水样、大气样和土壤中特定物质的含量，可以评估环境的质量和污染程度，并制定相应的环境保护措施。
2.4 药物研发与生产领域酶法分析在药物研发与生产领域中也有重要的应用。
它可以用来评估药物的纯度、活性和稳定性，以确保药物的质量和疗效。
同时，酶法分析还可以用于药物代谢及药代动力学的研究，以评估药物的吸收、分布、代谢和排泄等过程。
简议酶分析法
在一 定 的条 件 （ ｐ 值 和 温 度 ） 如 Ｈ ，测 定 反 应 的初 速率 ，而 反应 的初 速率 与被测 物质 的浓度成 一 定 比例关 系 ，因而 可通 过反应 的初 速率来 计算 ，或
用标 准 品对照 来计算 待测 物质 的量 。
方法 有 ，利用 待测 物质作 为酶促 反应 的底物 的 测定 法 ；利用 待测 物质作 为酶 促 反应 的辅 酶或抑 制
增 加或减 少 。包括 有紫外 一可见分光 光度 法 、荧光 分 析法 、酶偶 联测 定法 。 取 样测定 法 。将酶 和底 物混合 后 ，反应一 定 时
Ｍｅ ｉ ａ ｕ ｐ ｎ １ ２ Ｎｏ １ ｄ ｃ ｌＥｑ ｉ ｍｅ ｔＶｏ ． ４， ． ２
３ ２
问 ，然后 停止 反应 ，定 量测定 底 物减少 或产 物生 成
行酶 活力 的测定 。酶 活力测 定还 可用 于评价 产 品原 料 的质量好 坏 。 ３ 酶活力 测定 的方法 。 ．２
条 件 和测 定 方法 。
２ ．２ 特 征 。
选择性高。原则上 讲 ，一般 酶 只催 化一种 反 应 ，或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的 化学键起作用。 灵敏度高。一般可测到 １ 一ｍ ｌＬ ０ ｏ 。如与荧光 ／ 法联用，可高达 １ ｍ ｌＬ ０ ｏ 左右。 ／ 反应速度快 ，条件温 和。大多数 酶促反 应在
酶 是高效 、高度专 一 的生物催 化剂 ，它 和生命 活 动 密 切相关 。酶 主要 应用 于 ：制造某 些产 品 、去除某 些 物质 、识别 某种 化合 物 、测 定某 种物 质 。酶分析 法 是其 中的重 要 内容 ，作 为 一项 公 认 的分 析技 术 ， 正 在临 床诊 断 、食 品加 工发酵 、药 品生 产等方 面 广
酶法分析的基本原理和应用
酶法分析的基本原理和应用1. 概述酶法分析是一种常用的生化分析方法，利用酶在特定条件下对物质的特异性催化作用进行定量测定。
它具有高灵敏度、高选择性和实时监测等优点，因此在医学、食品安全、环境监测等领域得到广泛的应用。
2. 基本原理酶法分析的基本原理是利用酶催化底物与受体结合生成产物的特性，通过测量产物的数量来间接测定样品中目标物质的含量。
其原理主要包括以下几个方面：2.1 酶的选择性不同酶对底物的特异性结合和催化能力不同，可以选择与目标物质发生特异性反应的酶作为分析方法的基础。
例如，葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖的氧化反应，可以用于测定葡萄糖的含量。
2.2 底物与酶的反应底物与酶结合后形成底物-酶复合物，酶催化底物发生特定的反应，生成产物。
产物的数量与底物的浓度成正比关系，可以通过测定产物的数量来间接测定底物的含量。
2.3 受体结合和信号转导酶催化底物生成产物后，产物会与受体结合，触发一系列的信号转导过程。
这些信号转导过程可以通过荧光、吸光度、电化学或其他方法进行检测和定量。
3. 应用领域酶法分析具有广泛的应用领域，以下是几个常见的应用领域：3.1 医学诊断酶法分析在医学诊断中起到关键的作用。
例如，测定血清中的肝功能指标酶（如谷丙转氨酶）可以评估肝功能的健康状况；测定血液中特定酶的活性可以用于早期诊断某些疾病。
3.2 食品安全酶法分析可以用于食品安全领域，检测食品中的重金属、农药残留、催化剂等有害物质的含量。
例如，测定牛奶中的抗生素残留可以保障食品的安全。
3.3 环境监测酶法分析可应用于环境监测，检测水体中的污染物、土壤中的重金属、空气中的有害气体等。
通过测定目标分子的含量，可以评估环境的污染程度。
3.4 生物工程酶法分析在生物工程中也有广泛的应用。
例如，测定酶的活性可以用于评估工程菌株的合成能力，优化反应条件，提高产物的产量和纯度。
4. 优缺点酶法分析作为一种生化分析方法，具有以下优点：•高灵敏度和高选择性，可以进行低浓度目标物质的检测。
酶分析法的原理及应用
酶分析法的原理及应用1. 概述酶分析法是一种常用的生物化学分析方法，通过利用酶对底物的特异性反应来定量分析样品中的物质含量。
本文将介绍酶分析法的原理及其在科学研究和生物医学领域中的应用。
2. 酶的特性与原理酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应速度，而不被消耗。
它们具有高度的专一性，只对特定的底物进行反应。
酶的反应速率与底物浓度呈正比关系，且受到温度和pH值等环境因素的影响。
通常，酶分析法的原理基于底物和酶的反应产生的物质的可测量性。
常见的酶分析方法包括酶反应动力学法、酶抑制法、酶联免疫吸附法等。
3. 酶分析方法的应用3.1 酶测定法在生物化学研究中的应用酶测定法在生物化学研究中具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：•酶活性测定：通过测量酶催化底物转化产物的含量变化，可以确定酶催化反应的速率和活性。
•代谢物检测：许多代谢产物可以通过特定的酶催化反应转化成可测量的产物，从而快速检测和定量代谢产物的含量。
•蛋白质定量：一些酶能够特异性催化蛋白质的降解，通过测量酶反应产生的物质的含量变化，可以间接地确定蛋白质的含量。
3.2 酶分析法在生物医学领域中的应用酶分析法在生物医学研究和临床诊断中也具有重要的应用价值。
以下是一些常见的应用领域：•生物标志物的检测：许多疾病都伴随特定的生物标志物的变化，通过测量酶反应产物的含量变化，可以快速检测和诊断疾病。
•药物测定：酶反应可用于药物的定量分析，例如测定血液中药物的浓度，以指导药物治疗。
•免疫学研究：酶与抗体结合的酶联免疫测定法是一种常用的免疫学研究方法，可以检测特定抗体的存在和浓度。
4. 酶分析法的优缺点酶分析法具有以下优点：•高灵敏度：由于酶对底物的专一性反应，酶分析法能够检测到非常低浓度的底物。
•高选择性：酶对于特定底物的反应非常特异，可以避免其他杂质的干扰。
•快速和简便：酶分析法通常具有简单的操作步骤和快速的反应速率。
然而，酶分析法也存在一些缺点：•受环境条件影响：酶的反应速率受到温度和pH值等环境因素的影响，需要严格控制实验条件。
代谢物酶法分析技术
但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中，因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。
03
添加标题
在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法
添加标题
乳酸 + NAD+
添加标题
乳酸测定
添加标题
丙酮酸 + NADH + H+
添加标题
双底物反应直接测定法
添加标题
丙酮酸测定
单击此处添加标题
酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。
单击此处添加标题
酶循环法
单击此处添加标题
(3)
单击此处添加标题
产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。
过氧化物酶指示系统 共用的指示反应最早由Trinder氏等人提出，被称为Trinder反应 最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定
01
过氧化物酶指示系统
纯度主要指标 ①酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。②杂酶含量，容易引起副反应的一些酶含量按 “允许限度”的要求（见表5-2）。
试剂酶的质量要求
(1)
试剂酶的纯度要求
表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求
名称
来源
分子量
等电点
比活性 (U/mg)
杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）
葡萄糖氧化酶（GOD）
第四章 酶法分析
优点：
不需要特殊复杂的设备和仪器 灵敏度高 重复性好 对健康无害
应用前景
食品卫生 环境污染生化 指标 临床医学
“瘦肉精”快速检测新技术 ——竞争酶标免疫法
“瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的 作用于β —肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气 肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的5—10倍时， 可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦 肉精”。
应用时应考虑两个问题，即工具酶的用 量与反应的平衡点。
终点法要操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反 应于1级反应水平。因为这样可以使反应迅速 达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反 应；减少工具酶的用员。 (2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物 反应的另一底物应具有足够高的浓度。 (3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到 终点。
底物？ pH？ 温度？ 样品？
二、测定中应注意的问题 1.初速度
底物浓度对酶速的影响
浓度选择： a） [s]>=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。
作用于待测酶产物的其它酶；
（如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。
三、酶标免疫分析法
Enzyme Immunoassay (EIA)
在70年代初，从放射免疫分析发展起 来的一种称为“酶标免疫”的分析方法， 它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能 力有机地结合在一起，建立的一种高度特 异、灵敏的分析方法。
放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是用放射 性同位素标记抗原Ag*，该抗原与未标记抗原Ag竞 争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应 生成的Ag*-Ab复合物与Ag的量呈负相关。Ag*-Ab的 生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知 浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度， 这种分析方法称为放射免疫分析。
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术是一种用于研究生物体内代谢物的方法。
代谢物是生物体内产生的化学物质，包括代谢产物、药物代谢物等。
代谢物酶法分析技术通过测定代谢物与特定酶的反应产物来分析代谢物的含量、产量和代谢途径等，从而揭示生物代谢过程的机理和变化。
1.色谱法：色谱法是一种将混合物中的化学成分按照它们在固体或液体的固定相上的不同亲和性进行分离的技术。
在代谢物酶分析中，常用的色谱法有气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。
这些方法可以用于分离和定量分析代谢物的结构和浓度。
2.质谱法：质谱法是一种用于分析物质的质量和结构的方法。
在代谢物酶法分析中，常用的质谱法有质谱-质谱（MS-MS）联用技术。
这种方法可以用于快速、敏感地检测和定量代谢物的含量和代谢途径。
3.光谱法：光谱法是一种使用光线与物质相互作用并产生特定光谱的技术。
在代谢物酶法分析中，常用的光谱法有紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）和荧光光谱法等。
这些方法可以用于分析代谢物的结构、浓度和代谢动力学等。
4.电化学法：电化学法是一种利用电化学技术对化学反应进行研究的方法。
在代谢物酶法分析中，常用的电化学法有电化学检测法（EC）和电化学发光法（ECL）。
这些方法可以用于测定代谢物与特定酶的反应产物的电化学信号，并根据信号的强度来分析代谢物的含量和代谢途径等。
总的来说，代谢物酶法分析技术是一种重要的研究生物代谢过程的方法。
通过选择合适的分析技术，可以对代谢物的结构、浓度和代谢途径等
进行定量和定性分析，从而加深对生物代谢过程的理解，并为药物研发和生物医学研究提供重要的支持。
4-酶法分析
例2
胰蛋白酶效价测定 本品系自牛、羊、猪的膜中提取的蛋白水解酶。按干燥 品计算，每1mg的效价不得少于2500单位。
胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸 的羧基组成的肽键，酰胺键及酯键。其水解速率为酯键＞酰 胺键＞肽键。也可水解间位经基苯甲酸酶及脂肪酸酶，以及 变性蛋白如酶蛋白、血红蛋白。 可选用酪蛋白或含有碱性氨基酸的酰胺、酶等作为底物。 目前均采用专属性较高的 N-苯甲酰酰－L精氨酸乙酯（BAEE）作为本品的底物。
利于反应。
米氏常数Ｋm对于酶是特征性的。每一种酶对于它的一种底物只有一个 米氏常数。
米氏常数的求法 双 倒 数 方 程 和 双 倒 数 曲 线
1.0
0.8
0.6
1/v
0.4
0.2
0.0 -4 -2 0 2 4
-1
6
8
10
1/[S](1/mmol.L )
双倒数作图法
4.1.4 酶法分析注意点
酶分析法是一种以酶为分析工具（或试剂）的分析方法。分析 的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至酶的抑制剂。 酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同，但其所用的 酶量必须一定．被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最 适。
4.1.5 酶法分析的发展的历史
过氧化氢：过氧化物酶。140年以前，麦芽提取物为酶 源，以愈创木酚为共底物或指示剂测定。
蔗糖：转化酶。100余年以前，酶母提取液为酶源。
尿素：尿酶。1914年。 临床实验：转氨酶。1958年，诊断肝病和心脏病。 20世纪50年代以前，近60种物质能借助于酶法分析。 进展：取决于能否以合理的价格提供纯酶、底物和辅助 因子。
E + P
根据中间产物学说，在稳态时，ES的生成速度 与其分解速度相等。有以下关系式：
酶法解析
测酶活力就是在确定的最适反应条件下 测定酶促反应速度，
酶促反应速度取决于那些因素 ？
——速度方程
测定酶活力的基本要求：
1、要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度 的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；
2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大 能力）；
所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下 几方面做工作：
E1
A
B
E2 C
被测反应的产物是某脱氢酶的底物,即B 是脱氢酶E2的底物,测定系统中加入足量的 脱氢酶E2和NADH,使反应进行到C,然后通过 NADH的特征变化而测知。
HK
被测反应： G + ATP
G-6-P + ADP
偶联指示反
G6PDH
应： G-6-P + NADP
NADPH + 6-PGCOOH
以酶为分析对象，目的是检测食品、药物 体液等生物样品中酶的含量或活性；
如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定；
葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活 力测定等；
酶法分析（ENZYME ANALYSIS）
酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试 剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、 活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品 有关的样品中酶以外其他物质的含量。
第四章 酶分析法
酶分析法：
酶活力测定（酶研究的一部分） 酶法分析（酶作为分析的工具）
前者的目的在于检知样品中某种酶的 含量或活性，后者则主要用于测定与生 物学有关的样品中酶以外其它物质的含 量。两者检测对象不同，但原理基本一 致：酶的专一性、高效性，通过酶反应 速度测定物质的变化进行定量分析。
酶分析 （Enzyme Assay）
酶工程 第四节 酶分析法
2）、测反应的初速度
随着反应的进行，底物浓度下降和产物增加导 致逆反应从无到有，逐渐变得显著起来； 酸、碱、热等也在慢慢地使酶失活变性。
因此，这种情况下测的反应速度只是一种表观 的、各种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真 正活性，真正能代表酶催化活力的是反应初始阶段 的速度。 通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间
化学法:
是取样法的一种,比较古老,但目前仍普遍 使用。一是因为此法不需要特殊仪器，而且几 乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学
性质找出具体的有特异性的测定方法。
例：腈水合酶丙烯酰胺测定 （工作量大、含误差大、不够准确）
光学法（灵敏度高、快速、简便） 它是一种连续测定法，是根据底物 和产物在某一波长或波段上有明显特征 吸收差别而建立起来的方法。 光学法又可分为三种： 光吸收法； 荧光法； 旋光测定法。
所以：酶的单位数与速度值数值上相等
（一）、测定原理：
测酶活力就是在确定的最适反应条件下 测定酶促反应速度，
酶促反应速度取决于那些因素 ——速度方程
？
米氏方程
Michaelis & Menten根据中间产物学说推 导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度 关系的公式称为—— 米氏方程： V [S]
V = K max[S] m+
先不加底物L-Ala 测定空白值；
L-Ala + -酮戊二酸 丙酮酸 + NADH + H+ GPT LDH 丙酮酸 + L-Glu 乳酸 + NAD+
但是，血清中含有谷氨酸脱氢酶（GluDH)，
那么就有可能产生干扰，因为：
-酮戊二酸 + NADH + NH4 +
第02章-酶分析法
2.2.2 pH值
H+能对酶反应产生多种影响：①可能改变酶活 性中心的解离状况，升高或降低酶的活性；② 可能破坏酶的结构与构象导致失效；③可能作 用反应系统的其它组成成分影响酶反应，甚至 改变可逆反应进行的方向。如：乳酸脱氢酶反 应在pH 7时向乳酸生成方向进行，而pH l0时则 倾向于丙酮酸的形成。
2.3 测定方法 测定方法有取样法和连续法。 取样法：在酶反应开始再根据产物和底物在化学性质 上的差别进行分析，求得单位时间内酶促反应 变化量的方法。 连续法：基于底物和产物在物理化学性质上的 不同，在反应过程中对反应系统进行直接、连 续观察的方法。
如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最适反应条件(如 温度、pH等)的确定很重要，一个熟练的酶学工作者，会考虑各种 因素，设计的实验比较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人， 往往容易出错。
1.3 酶分析法的意义
酶的应用大致可分为四个方面：
(1)用以制造某些产品； (2)用以去除某些物质；
2.2 反应条件的确定 选择反应条件的基本要求是，所有待测定的酶 分子都应能正常地发挥作用。 也就是说，反应系统中除了待测定的酶浓度是 影响反应速度的唯一因素外，其它因素都应处 于最适条件。
2.2.1 底物
①底物(包括人工合成底物)最好在物理化学性质上 和产物不同。 有些酶作用的底物和产物本身就有这种特点， 如脱氢酶用的NAD(P)+和NAD(P)H； 有的则需加工成色源或荧光源底物，在酶作用 后产物产生颜色或荧光。如磷酸酯酶测定可用 对硝基苯磷酸。
2.2.5 样品
许多待测样品常常包含各种干扰因素，如可能 存在着作用同一底物或产物的其它酶。因此测 定前应检测系统中是否杂有这些干扰因素。 同时采用不同的测定方法和同时检测底物和产 物的变化量，然后观察测得的结果是否一致。 通过这些比较分析，确定是否存在干扰。
第25章 临床酶法分析的原理与方法
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第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
酶法分析的优点 优
1
点
由于酶作用的特异性高，成份复杂的血清等体液 样品不需进行预处理就能测定，简化了实验程序
由于酶具有高催化效率，加快了反应速度，提髙 了工作效率 试剂酶的本质大多是蛋白质，酶促反应的条件温 和，没有毒性，避免了化学品对人体的危害和对 环境的污染 制成试剂盒即可以手工操作，又可以自动化分析
主要内容
酶法分析方法的理论基础
酶反应前后光吸收变化测定的与原理与方法
脱氢酶指示系统测定的原理与方法 过氧化物酶指示系统测定的原理与方法 酶循环测定的原理与方法 酶激活与酶抑制测定的原理与方法
第 3页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
第一节
酶法分析方法的理论基础
酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、 辅酶、辅基、激活剂、抑制剂以及酶偶联法测 定酶活性等的一类方法。 临床酶法分析是指用酶法分析的方法来测定人 体內的代谢物或代谢产物的技术。
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第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
表25-1 常用的Trinder反应生色基团
化学名 酚 2,4-二氯酚 英文缩写 P 2,4-DCP 最大吸收峰（nm） 500 510 555 555
N- 乙 基 -N- （ 3- 甲 EMAE 苯-N-乙酰乙二胺 N- 乙 基 -N- （ 2- 羟 TOOS 基 -3- 丙 磺 酰 ） 间 甲苯胺 N- 乙 基 -N- （ 3- 丙 ESPDMA 磺酰）-3,5二甲氧 基苯胺
如尿酸在293 nm处有特异性的光吸收，但经过尿 酸氧化酶（UAO）催化生成的尿囊素则在293 nm 处无特异性光吸收，可以通过尿酸在293 nm处的 吸光度下降来计算尿酸的浓度。
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13
第九节 酶法放射分析和放射酶促析法
岳 凌
一、概 述
1. 酶法放射分析 酶法放射分析是基于酶促反应， 酶法放射分析是基于酶促反应，使放射性标记 底物转变为放射性标记产物， 转变为放射性标记产物 底物转变为放射性标记产物，分离提纯放射性标记 产物，测定其放射性活度，从而测定酶的活性 酶的活性或 产物，测定其放射性活度，从而测定酶的活性或定 量分析待测底物等的一种微量分析技术 等的一种微量分析技术。 量分析待测底物等的一种微量分析技术。
8
三、基本技术
1. 酶液的制备
1）对细胞外酶，可取样本直接测定； ）对细胞外酶，可取样本直接测定； 2）对细胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理，再提取分 ）对细胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理， 离酶。 离酶。 具体的方法主要有密度梯度离心法、有机溶剂提取法、 具体的方法主要有密度梯度离心法、有机溶剂提取法、吸 附法、层析法等。 附法、层析法等。
6
二、基本原理
1. 酶活性放射性分析 E + *S 酶 E *S E*P E + *P 酶 产物 底物 中间产物 络合物
酶活性 ＝ P/(60×SA×t)
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Pm ＝
Pd 60 × SA × K
2. 酶促同位素衍生物法 酶促同位素衍生物法：
单标记法 Pm＝ Pd/(60×SA×K) ＝ 双标记内标准法
9
2. 标记底物的制备
1）定位标记 ） 2） 2）放化纯度高 3）浓度适当 ） 4）比活度适当 ）
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3. 底物与产物的分离技术
1）固相法 ） 2）沉淀法与薄板层析法结合 ） 3）挥发性产物的分离 ）
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复习题
1. 几种酶法放射分析的原理
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பைடு நூலகம்
参考文献
图书资料 《化学标记与探针技术在分子生物学中的应用》
5
3. 酶活性与酶的活性单位
酶的活性
指酶催化化学反应的能力，以酶促反应速度的大小来 衡量。 衡量。 指酶催化化学反应的能力， 酶促反应速度： 酶促反应速度：以单位时间内底物的实际消耗量或产物的生成量 来表示。 来表示。
酶的活性单位
开特（ ）：在特定测定系统中 开特（Katal）：在特定测定系统中，每秒种转化 ）：在特定测定系统中，每秒种转化1mol底物所需 底物所需 的酶量。 的酶量。
2
2. 分类 1) 酶活性放射分析 2) 酶促放射分析（酶促同位素衍生物分析） 酶促放射分析（酶促同位素衍生物分析） 3) 酶的激活剂或抑制剂的酶法放射分析
3
二、基本原理
一、几个基本概念 1. 酶反应动力学方程 E + S 酶 底物 ES 中间产物 E + P 酶 产物
4
2. 米－曼氏方程式 V = Vmax ×[S] Km+[S] Km值相当于酶促反应速度为最大速度一半时的底 值相当于酶促反应速度为最大速度一半时的底 物浓度， 物浓度，它是酶的特征性常数 。