微生物染色

实验3微生物的染色

3．1实验目的

(1)了解微生物的染色原理。

(2)学习微生物涂片染色操作技术。

(3)掌握微生物单染色及革兰氏染色方法。

3．2染色原理

一般微生物，特别是细菌无色透明，在光学显微镜下，菌体与背景的反差很小，难以分辨其形态与结构，染色后可增加其反差，以利于观察。

(1)单染(普通染色)

单染是只用一种染料使菌体着色，便于观察菌体的形态。

菌体内含有大量的蛋白质，使微生物细胞具有两性电解质性质，在某一pH值时，菌体所带的正负电荷相等，该pH 值即为细胞的等电点(pI)。通常细菌的等电点约为2～5。

当环境的pH值比菌体的等电点低时，菌体带正电荷，易与带负电荷的酸性染料结合。在细菌所要求的pH值(中性或略大于中性)条件下，细菌带有负电荷，故多以碱性染料染色。常用的碱性染料有结晶紫、龙胆紫、美蓝、碱性品红、孔雀绿、番红花红及中性红等。

(2)革兰氏染色(复染色法或鉴别染色法)

革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴定方法。该方法是l884年由丹麦学者Christain Gram 创立的，此后人们在实践中又作了一些改进。通过这种方法可将细菌分为革兰氏染色阳性细菌(G+)和革兰氏染色阴性细菌(G-)两大类。其基本原理如下。

革兰氏染色结果是由细菌的细胞壁决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁肽聚糖含量高且呈网状结构，细胞壁较厚，类脂质含量低；革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖含量低，细胞壁薄，类脂质含量高。前者用酒精脱色时，细胞壁因脱水肽聚糖层网孔变小，其通透性降低，使结晶紫-碘的复合物不易被抽取而继续留在细胞内，经脱色和复染后仍保留着初染剂结晶紫的颜色(紫色)；后者用酒精脱色时，类脂质被酒精溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫-碘的复合物易被抽取出来，紫色褪去，用复染剂复染后，细胞的颜色即呈复染剂的颜色(红色)。革兰氏染色最关键的步骤是酒精脱色。事实上，用结晶紫进行初染时所有的细菌都被染成紫色。碘是一种媒染剂，能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，以增强染料与细菌的结合力。只有经过酒精处理，再经复染，不同的细菌才会显现出不同的染色结果。

3．3实验仪器、材料

(1)显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。

(2)美蓝染液、结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红花红染液。

(3)大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、活性污泥等。

3．4操作步骤

(1)单染

①涂片(图12)在干净的载玻片中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧灼，冷却后，以无菌操作(图12)挑取少量菌种于载玻片水滴中，或用吸管直接滴一滴活性污泥悬液于载玻片上，混匀并涂成薄膜，注意涂布面积不要太大。

②干燥自然干燥。

③固定将已干燥的涂片正面朝上，于火焰顶上迅速通过2～3次，使其蛋白质凝固，以固定细菌外形，并使其不易脱落。但切忌直接在火上烧玻片，以防菌体变形。

④染色在涂片薄膜上滴加染液(美蓝或结晶紫)1～2min。

⑤水洗倾斜载玻片，打开水龙头，用细水流冲洗(最好沿载玻片对角线冲洗)，直至冲洗水无色为止。

图12无菌操作和涂片方法

(a)烧接种环灭菌；(b)拔下棉塞；(c)轻烧试管口；(d)接种环伸进试管挑菌；(e)取出接种环，再烧一烧试管口；(f)塞好棉塞，(g)涂片；(h)烧灼接种环；⑥镜检用吸水纸轻轻地将涂片边缘的水珠吸掉，晾干后于显微镜下观察，并绘图。

(2)革兰氏染色(图13)

①涂片同单染。

图13革兰氏染色过程

(a)加结晶紫染lmin；(b)水洗；(c)加碘液媒染lmin；(d)水洗；(e)酒精脱色；(f)水洗；(g)番红花红复染2min；(h)水洗；(i)用吸水纸吸干

②干燥同单染。

③固定同单染。

④初染结晶紫染色lmin，水洗。

⑤媒染用碘液媒染lmin，水洗。

⑥酒精脱色倾斜载玻片，滴加乙醇至流下的乙醇不显紫色(或20～30s)，立即水洗。这是革兰氏染色最关键的一步，脱色过度，本来的阳性菌会被误认为是阴性菌；脱色欠度，阴性菌会被误认为是阳性菌，均造成错误结果。

⑦复染番红花红复染2min，水洗。

⑧镜检用吸水纸吸走水滴，晾干后，用显微镜观察。

3．5实验报告

绘出菌体形态，并给出革兰氏染色结果。

思考题

1．简述微生物染色原理。

2．革兰氏染色中若不用番红花红复染，能否区分G+菌和G-菌?请解释。