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低熔点／凝点琼脂糖 通过羟乙基化修饰的琼脂糖在较低的温度熔化，
羟乙基化替代的程度决定准确的熔化和凝结温度。低熔点／凝点琼脂糖 主要用于DNA的快速回收，因为大多数该类型琼脂糖在65℃熔化，这个 温度远低于双链DNA的解链温度。这种特性使它还可以用于DNA的简单 纯化和酶处理；在熔化的凝胶中用核酸直接进行细菌转化。化学修饰的 琼脂糖比等浓度的标准琼脂糖有更高的筛分能力。该发现使琼脂糖的分 辨 力接近聚丙 烯酰胺凝胶 ，因此可用 于 PCR产物 、小片段DNA和 小 RNA(<lkb)的分离。现在它能分辨少至4bp的DNA和分离200-800bp范围 内相差2％的DNA片段。
DNA大小标准品
通常使用已知分子质量的DNA样品，它们是经限制 性酶消化已知序列的质粒或噬菌体DNA获得的。琼 脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳用的分子质量标准可以 从市场购得，或者实验室自己制备。一般最好有两 套分子质量范围的标准，一个是1kb到大于20kb的 高分子质量标准，一个是100-1000bp的低分子质量 标准。分子质量标准贮备液用凝胶载样缓冲液稀释 后用于每次电泳实验。
专题三核酸电泳技术
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心 技术之一，它用于分离、鉴定和纯化DNA片段。
该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法 如密度梯度离心等不能满意分离的DNA片段。 此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插 入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到， 甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下 也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA 条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。
溴化乙锭与核酸结合
➢ 溴化乙锭包含一个平面的三环菲啶环，它能插入到双链DNA 堆叠的碱基对之间。当它插入到螺旋结构中，将保持与螺旋 结构纵轴垂直的位置，并在其上下方与碱基对形成范德华接 触。尽管其平面三环结构被包埋，其外围苯基及乙基基团却 伸出插入到DNA双螺旋结构的大沟中。在高离子强度的溶液 中，大约每2.5个碱基对中插入一个分子的溴化乙锭，且与 DNA的碱基组成无关。除沿螺旋纵轴方向发生3.4A的位置偏 移外，碱基对的几何结构和位置相对于螺旋结构并未发生改 变。这使得与溴化乙锭结合达到饱和的双链DNA的长度增加 了27％。
溴化乙锭
溴化乙锭首先于20世纪50年代合成成功，主要是作 为一种有效的杀锥虫制剂而发展起来的菲啶化合物。 溴化乙锭在筛选过程中脱颖而出。它的杀锥虫效能 是其母化合物的10～50倍，并对小鼠无毒，且与早 期的菲啶化合物不同，对牛不具有光致敏作用。直 到最近，溴化乙锭在热带及亚热带国家仍被广泛应 用于牛锥虫病的治疗和预防。
琼脂糖
标 准 ( 高 熔 点 ) 琼 脂 糖 制 造 它 的 原 料Biblioteka Baidu是 两 种 海 藻 ， Gelidium 和
Gracilaria。这两种琼脂糖的凝点和熔点有所不同，但是在实际应用中每 种来源的琼脂糖都可以用于分析或分离1-25kb范围的DNA片段。新类型 的标准琼脂糖具有高凝胶强度和低电内渗(EEO)，可以灌制浓度低至0.3 ％的凝胶。这种凝胶用于电泳能方便地分离高分子质量DNA(直到60kb)。 它在任何浓度下DNA迁移速度均比通用的标准琼脂糖快10％-20％。这一 增加在百万碱基大小DNA的PFGE中将明显地节省时间。
电泳缓冲液
凝胶载样缓冲液
载样缓冲液有三个作用：
➢ 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内； ➢ 使样品带有颜色便于简化上样过程； ➢ 其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。 ➢ 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，这
一特性与琼脂糖浓度无关。在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中 溴酚蓝迁移速率约与长300bp的线状双链DNA相同，而二甲 苯氰FF约与长4000bp的DNA相同。上述关系在浓度范围0.5 ％～1.4％的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。用哪 种载样缓冲液是个人的习惯。
➢ 溴化乙锭也同样可以通过不同的化学作用方式与RNA以及热 变性或单链DNA链内碱基对所形成的螺旋结构区相结合。
➢ 溴化乙锭平面基团的固定位置以及它与碱基的高度临近 使被结合的染料所产生的荧光与在自由溶液状态的染料 相比增强20～25倍。254 nm的紫外线首先被DNA吸收， 然后被传送到染料；而302nm以及366 nm的射线直接被 染料自行吸收。这些被吸收的能量将在590nm的橙红色 可见光谱区以0.3的量子产额被重新释放出来。
双链DNA的定量分析
一种快捷和灵敏的方法是应用溴化乙锭分子的插入 可通过紫外线照射产生荧光。由于荧光的亮度与 DNA的含量成相关，DNA的含量可通过样品在590 nm处的光量度与一系列标准品的对照来估算。
➢ 大部分商品化的紫外线光源产生302 nm的紫外线。溴化 乙锭-DNA复合物在受到紫外线照射激发所产生的荧光， 在302nm的紫外线下明显要比366nm的要强，但要比短 波紫外线(254nm)的稍弱。然而，302 nm紫外线所造成 染料的光褪色效应以及造成DNA的断裂和缺口明显要 较254nm紫外线少得多。
凝胶中DNA的染色
➢ 溴化乙锭被广泛地用于琼脂糖凝胶中DNA片段的定位，通常将它以 0.5μg/ml的浓度被加入到胶中以及电泳缓冲液中。尽管加入溴化乙锭 会导致线性双链DNA的电泳迁移率减慢～15％，但却可在紫外灯下直 接检查凝胶。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光强度要比未结合的染 料强很多，少量的DNA(～10 ng／条带)也能从存在游离状态溴化乙锭 的凝胶中被检测出来。
➢ 当需要知道DNA片段的准确大小(如DNA限制酶酶切图谱的鉴定)，凝 胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。染色时，将凝胶 浸入含有EB(0.5μg/ml)的电泳缓冲液中，室温下染色30～45 min。染 色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA(<10 ng)片段时， 通 常要将 染色 后的凝 胶浸 入水中 或1mmol/L MgSO4中 ，室温脱 色 20min更易观察到。
羟乙基化替代的程度决定准确的熔化和凝结温度。低熔点／凝点琼脂糖 主要用于DNA的快速回收，因为大多数该类型琼脂糖在65℃熔化，这个 温度远低于双链DNA的解链温度。这种特性使它还可以用于DNA的简单 纯化和酶处理；在熔化的凝胶中用核酸直接进行细菌转化。化学修饰的 琼脂糖比等浓度的标准琼脂糖有更高的筛分能力。该发现使琼脂糖的分 辨 力接近聚丙 烯酰胺凝胶 ，因此可用 于 PCR产物 、小片段DNA和 小 RNA(<lkb)的分离。现在它能分辨少至4bp的DNA和分离200-800bp范围 内相差2％的DNA片段。
DNA大小标准品
通常使用已知分子质量的DNA样品，它们是经限制 性酶消化已知序列的质粒或噬菌体DNA获得的。琼 脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳用的分子质量标准可以 从市场购得，或者实验室自己制备。一般最好有两 套分子质量范围的标准，一个是1kb到大于20kb的 高分子质量标准，一个是100-1000bp的低分子质量 标准。分子质量标准贮备液用凝胶载样缓冲液稀释 后用于每次电泳实验。
专题三核酸电泳技术
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心 技术之一，它用于分离、鉴定和纯化DNA片段。
该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法 如密度梯度离心等不能满意分离的DNA片段。 此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插 入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到， 甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下 也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA 条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。
溴化乙锭与核酸结合
➢ 溴化乙锭包含一个平面的三环菲啶环，它能插入到双链DNA 堆叠的碱基对之间。当它插入到螺旋结构中，将保持与螺旋 结构纵轴垂直的位置，并在其上下方与碱基对形成范德华接 触。尽管其平面三环结构被包埋，其外围苯基及乙基基团却 伸出插入到DNA双螺旋结构的大沟中。在高离子强度的溶液 中，大约每2.5个碱基对中插入一个分子的溴化乙锭，且与 DNA的碱基组成无关。除沿螺旋纵轴方向发生3.4A的位置偏 移外，碱基对的几何结构和位置相对于螺旋结构并未发生改 变。这使得与溴化乙锭结合达到饱和的双链DNA的长度增加 了27％。
溴化乙锭
溴化乙锭首先于20世纪50年代合成成功，主要是作 为一种有效的杀锥虫制剂而发展起来的菲啶化合物。 溴化乙锭在筛选过程中脱颖而出。它的杀锥虫效能 是其母化合物的10～50倍，并对小鼠无毒，且与早 期的菲啶化合物不同，对牛不具有光致敏作用。直 到最近，溴化乙锭在热带及亚热带国家仍被广泛应 用于牛锥虫病的治疗和预防。
琼脂糖
标 准 ( 高 熔 点 ) 琼 脂 糖 制 造 它 的 原 料Biblioteka Baidu是 两 种 海 藻 ， Gelidium 和
Gracilaria。这两种琼脂糖的凝点和熔点有所不同，但是在实际应用中每 种来源的琼脂糖都可以用于分析或分离1-25kb范围的DNA片段。新类型 的标准琼脂糖具有高凝胶强度和低电内渗(EEO)，可以灌制浓度低至0.3 ％的凝胶。这种凝胶用于电泳能方便地分离高分子质量DNA(直到60kb)。 它在任何浓度下DNA迁移速度均比通用的标准琼脂糖快10％-20％。这一 增加在百万碱基大小DNA的PFGE中将明显地节省时间。
电泳缓冲液
凝胶载样缓冲液
载样缓冲液有三个作用：
➢ 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内； ➢ 使样品带有颜色便于简化上样过程； ➢ 其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。 ➢ 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，这
一特性与琼脂糖浓度无关。在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中 溴酚蓝迁移速率约与长300bp的线状双链DNA相同，而二甲 苯氰FF约与长4000bp的DNA相同。上述关系在浓度范围0.5 ％～1.4％的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。用哪 种载样缓冲液是个人的习惯。
➢ 溴化乙锭也同样可以通过不同的化学作用方式与RNA以及热 变性或单链DNA链内碱基对所形成的螺旋结构区相结合。
➢ 溴化乙锭平面基团的固定位置以及它与碱基的高度临近 使被结合的染料所产生的荧光与在自由溶液状态的染料 相比增强20～25倍。254 nm的紫外线首先被DNA吸收， 然后被传送到染料；而302nm以及366 nm的射线直接被 染料自行吸收。这些被吸收的能量将在590nm的橙红色 可见光谱区以0.3的量子产额被重新释放出来。
双链DNA的定量分析
一种快捷和灵敏的方法是应用溴化乙锭分子的插入 可通过紫外线照射产生荧光。由于荧光的亮度与 DNA的含量成相关，DNA的含量可通过样品在590 nm处的光量度与一系列标准品的对照来估算。
➢ 大部分商品化的紫外线光源产生302 nm的紫外线。溴化 乙锭-DNA复合物在受到紫外线照射激发所产生的荧光， 在302nm的紫外线下明显要比366nm的要强，但要比短 波紫外线(254nm)的稍弱。然而，302 nm紫外线所造成 染料的光褪色效应以及造成DNA的断裂和缺口明显要 较254nm紫外线少得多。
凝胶中DNA的染色
➢ 溴化乙锭被广泛地用于琼脂糖凝胶中DNA片段的定位，通常将它以 0.5μg/ml的浓度被加入到胶中以及电泳缓冲液中。尽管加入溴化乙锭 会导致线性双链DNA的电泳迁移率减慢～15％，但却可在紫外灯下直 接检查凝胶。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光强度要比未结合的染 料强很多，少量的DNA(～10 ng／条带)也能从存在游离状态溴化乙锭 的凝胶中被检测出来。
➢ 当需要知道DNA片段的准确大小(如DNA限制酶酶切图谱的鉴定)，凝 胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。染色时，将凝胶 浸入含有EB(0.5μg/ml)的电泳缓冲液中，室温下染色30～45 min。染 色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA(<10 ng)片段时， 通 常要将 染色 后的凝 胶浸 入水中 或1mmol/L MgSO4中 ，室温脱 色 20min更易观察到。