实验三 硝酸还原酶活性测定

6. 注意事项
抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中； ① 抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中； ② 硝酸还原过程应在黑暗中进行； 硝酸还原过程应在黑暗中进行； ③ 磺胺试剂和 萘胺试剂加入时，注意顺序； 磺胺试剂和α-萘胺试剂加入时 注意顺序； 萘胺试剂加入时， 正确使用分光光度计； ④ 正确使用分光光度计； 避免移液管使用交叉感染。 ⑤ 避免移液管使用交叉感染。
1. 实验目的意义
硝酸还原酶（ 硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写 ）是硝酸盐同化中第一 ，缩写NR） 个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。 个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植 物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响， 物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响， 因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之 也可作为品种选育的指标之一。 一，也可作为品种选育的指标之一。
实验3 实验3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原 NR） 酶（NR）活性的影响
硝酸还原酶
植物从土壤中吸收的NO 必须经代谢性还原才能被利用， 植物从土壤中吸收的NO3－必须经代谢性还原才能被利用，因 细胞组分中的N均呈高度还原态， 中的N 为细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO3－中的N为高度氧化 态。
受光促进
3. 材料与试剂
两种处理的小麦： 两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N） ， ） A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 磷酸缓冲液 溶液: 溶液 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 溶液
磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液 0.2mol/L 溶液: 磷酸缓冲液 ； DNP (2-4-二硝基苯酚 溶液 1mmol/L； 蔗糖溶液 2.5mmol/L 二硝基苯酚)溶液 二硝基苯酚 溶液: ； 蔗糖溶液:
两种处理的小麦幼苗叶片 中段各取0.3g (各2份) 中段各取 各 份 10 ml A液 液
水(ck)
KNO3 （N） ） A液 液 B液 液 放气后摇晃直至叶 段沉于溶液中
B液 液
抽气30分钟 抽气 分钟 25～30℃温箱中黑暗保温 分钟 ～ ℃温箱中黑暗保温30分钟 黑暗保温 液或B液 取A液或 液1ml 液或 代替反应液作为 对照管
来自百度文库
磺胺试剂 α-萘胺试剂 萘胺试剂
4. 实验步骤
取样前一天， 加到培养小麦的水中，光照，以诱导硝酸 ① 取样前一天，用50mM KNO3加到培养小麦的水中，光照，以诱导硝酸 还原酶产生 产生。 还原酶产生。 两种材料[水 各取2份新鲜叶片中段 ② 两种材料 水 (ck)，KNO3 (N)]各取 份新鲜叶片中段， 用蒸馏水洗净、 ， 各取 份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、 擦干，剪成1cm小段，称取 克；将4份（ck、N）叶段分别置于含有 小段， 擦干，剪成 小段 称取0.3克 份 、 ） 10ml A、B溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管； 溶液的两只试管中， 四管； 、 溶液的两只试管中 、 、 和 四管 用纱布将材料压于试管底部，将试管放在真空干燥器中抽气30分钟 分钟， ③ 用纱布将材料压于试管底部 ， 将试管放在真空干燥器中抽气 分钟 ， 放气后摇晃直至叶段沉于溶液中； 放气后摇晃直至叶段沉于溶液中； 将试管置于25～ ℃温箱中，黑暗保温 分钟； 保温30分钟 ④ 将试管置于 ～30℃温箱中，黑暗保温 分钟； 立即吸取1ml反应液，加入 反应液， 磺胺试剂， ⑤ 立即吸取 反应液 加入2ml磺胺试剂，摇匀，再加入 磺胺试剂 摇匀，再加入2mlα-萘胺试剂 萘胺试剂 用漩涡仪混合摇匀， 水浴（水浴锅）反应5分钟 分钟, （注意顺序），用漩涡仪混合摇匀，25 ℃水浴（水浴锅）反应 分钟 取出后桌面静置10分钟 随后5分钟内 分钟， 分钟内， 取出后桌面静置 分钟 ， 随后 分钟内 ， 在 540nm测定样品的吸光值 测定样品的吸光值 以蒸馏水为对照） （以蒸馏水为对照）。 液和B液 代替反应液， 磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂， 作 萘胺试剂， ⑥ 取 A液和 液1ml代替反应液， 加入 液和 代替反应液 加入2ml磺胺试剂和 磺胺试剂和 萘胺试剂 为对照管， 测定样品的吸光值（ 为对照管，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照） 。 测定样品的吸光值 以蒸馏水为对照）
7. 思考题
1） 为何提前一天施 ） 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？ 并且取样应在晴天进行？ 2） NR酶活性（ NO2- ，uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ） 酶活性（ ） 酶活性 鲜重g× ×10ml/1ml ÷（鲜重 ×0.5h） ） 公式中的0.5 h 指哪一个？ 指哪一个？ 公式中的
（不稳定，见光容易分解，测定需迅速。） 不稳定，见光容易分解，测定需迅速。
当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与 当磺胺与 萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成 萘胺均过量时 直线关系。 直线关系。 NO2-含量标准曲线： 含量标准曲线： [ NO2- ](µmol/ml) = 0.0026＋0.359OD540 ＋ [NO2-] (µmol/ml)×稀释倍数 鲜重(g)×时间 鲜重 ×时间(h)
NO2-含量测定（磺胺比色法） 含量测定（磺胺比色法）
在酸性溶液中， 与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与 萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在 540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。 有最大吸收峰， 有最大吸收峰 可以用分光光度计测定（
反应液+2ml磺胺试剂 磺胺试剂+2ml α-萘胺试剂 注意加液顺序 取1ml反应液 反应液 磺胺试剂 萘胺试剂 混匀 25 ℃水浴反应5分钟 水浴反应 分钟 取出后桌面静置10分钟 取出后桌面静置 分钟 540 nm测定样品的吸光值 测定样品的吸光值
5. 结果与分析
分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。 分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。
硝酸盐的还原由硝酸还原酶 (nitrate NR)催化 催化。 硝酸盐的还原由 硝酸还原酶(nitrate reductase, NR) 催化 。 硝酸还原酶 硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。 硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。 诱导酶(induced enzyme): 植物体本来不含有， 诱导酶 (induced enzyme): 植物体本来不含有 ， 但在特定外 来物质(如底物)的诱导下,可以产生的酶。 来物质(如底物)的诱导下,可以产生的酶。
掌握硝酸还原酶活性的测定方法 了解硝酸还原酶的特性
2. 实验原理
硝酸还原酶可将 还原成NO2- ，其反应为： 其反应为： 硝酸还原酶可将NO3-还原成 酶可将
NO3- + NADH + H+
NR
NO2- + NAD+ + H2O
在一定条件下， 在一定条件下 ， NO2- 的生成量与硝酸还原酶的活性 呈正相关， 因此， 可以测定NO2- 的生成量来代表硝酸还 呈正相关 ， 因此 ， 可以测定 原酶的NR活性 活性。 原酶的 活性。
处 理 A液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性 B液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
H2 O KNO3 对照 [ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD520 ） ＋ NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重 ×0.5h） 活性（ 鲜重g× 活性 ） ）
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白， 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止 所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 可还原 以保证测定结果的准确。 应，以保证测定结果的准确。
NR活性 活性(NO2- , µmol/h•gfw) = 活性
硝酸还原酶活性测定
离体法：将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣， 离体法：将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液 为硝酸还原酶粗酶液进行测定。 为硝酸还原酶粗酶液进行测定。 缺点：由于研磨中NADH受损失，必需外加 受损失， 方可测定。 缺点：由于研磨中 受损失 必需外加NADH方可测定。 方可测定 活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后 活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的 被NR还原成 还原成NO2-， 并扩散到细胞外在溶液中积累，测 并扩散到细胞外在溶液中积累， 还原成 定溶液中NO2- 的含量即可得知 的大小。 的含量即可得知NR的大小 的大小。 定溶液中 优点：不破坏细胞原有的酶反应系统， 优点：不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不 可由代谢反应不 断生成， 无需外加。 简便、 快速， 断生成 ， 无需外加 。 简便 、 快速 ， 不需要贵重仪器设 备及低温条件。 备及低温条件。 缺点: 重复性欠佳，应作一定量的重复。 缺点 重复性欠佳，应作一定量的重复。