结晶乳酸脱氢酶的提取

实验一 乳酸脱氢酶的提取、纯化及活性测定

一、原理

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, 简称LDH 、EC 、1、1、1、27）存在于一切有糖酵解作用的细胞

中，最早从牛心肌中分离并获得结晶，后来相继又从兔骨骼肌、鼠肝、猪心及枯草芽胞杆菌等材料中分离

出来。它是可溶性的酶，在NAD +的存在下，催化乳酸脱氢形成丙酮酸或使丙酮酸还原成乳酸，反应如下：

乳酸＋NAD + −−→−LDH 丙酮酸+NADH+H +

丙酮酸+2,3－二硝基苯肼−−−→−-O H 2丙酮酸―2,4―二硝基苯腙

↓

棕红色的苯腙硝醌化合物

因此，乳酸脱氢酶是肌肉糖酵解过程中的一个重要氧化还原酶。

提取和纯化乳酸脱氢酶的基本方法是用磷酸盐缓冲液抽提，用不同饱和度的硫酸铵分级盐析进行分离

等。为了进行乳酸脱氢酶同功酶的研究，在上述基础上还需进一步纯化。一般采用离子交换或分子筛进行

柱层析。

浓的乳酸脱氢酶溶液在3～15℃下可稳定几个月，但是高度稀释的酶溶液是很不稳定的。一般可将结

晶酶置于0.5饱和度硫酸铵溶液中，在低温下保存；或对0.1M ，Ph7.0磷酸盐缓冲液透析后冰冻保存，大

约在2个月内活性不降低。

从牛心肌中分离出来的乳酸脱氢酶分子量为135,000±15,000，具有4个H 型（H 4）亚基。乳酸脱氢酶

是一个重要的同功酶，有一定的器官特异性，它的变化在一定程度上更加敏感地反映器官的功能状态，因

此在临床诊断上有重要意义。该酶对一般的抑制剂有较高的稳定性，但对氯汞苯甲酸可引起酶的完全失活，

而半胱氨酸能使活力恢复。

乳酸脱氢酶具有底物立体专一性，要求L （+）－乳酸作为底物，它与某些来源于细菌的乳酸脱氢酶不

同，那些乳酸脱氢酶可使丙酮酸还原成D 或DL －乳酸。

酶活性的测定：采用2,4-二硝基苯肼比色法测定其总酶活性。以乳酸为底物，经LDH 催化，脱氢生成

丙酮酸，与2,4-二硝基苯肼反应，在碱性条件下，产物呈棕红色，于500nm 波长处比色，测得LDH 酶活性。

二、试剂与器材

试剂：

1．0.05M ，pH7.4磷酸盐缓冲液

2．0.08M ，pH7.0磷酸盐缓冲液

3．0.5M DL-乳酸钠溶液

4．0.002M NAD +溶液

5．0.1M pH10.0甘氨酸－氢氧化钠缓冲液

6．底物溶液：甘氨酸－NaOH 缓冲液2.7ml ，乳酸钠0.15ml ，NAD + 0.15ml 混合溶液。

7．2,4－二硝基苯肼：精确称取2,4－二硝基苯肼19.8mg ，溶于10mol/L 盐酸10ml 中，溶解后再加蒸

馏水至100ml 。

8．0.4M NaOH 溶液。

9．丙酮酸标准液。

10．DEAE-Sephadex-A50树脂。

器材：

1．普通离心机

2．低温高速离心机

3．紫外分光光度计

4．721分光光度计

5．层析柱

6．电动搅拌机

三、操作步骤

（一）配置缓冲液：

1.0.05M，pH7.4磷酸盐缓冲液：

A液，配0.2M,Na2HPO4200Ml:71.5 g Na2HPO4溶于1000mL蒸馏水中；

B液，配0.2M,NaH2PO4100Ml:31.2g Na2HPO4溶于1000mL蒸馏水中；

C液：0.2M，pH7.4磷酸盐缓冲液：A液：B液=405mL：95 mL。4NNaOH调pH到7.4。

0.05M，pH7.4磷酸盐缓冲液：用时4倍稀释C液。

2．0.08M，pH7.0磷酸盐缓冲液：

D液：0.2M，pH7.0磷酸盐缓冲液：A液：B液=61mL：39 mL。4NNaOH调pH到7.0

0.08M，pH7.0磷酸盐缓冲液：用时2.5倍稀释C液。

（二）装柱：

1.将层析柱用铁架台垂直固定好，内装8cm高的0.08M，pH7.0磷酸盐缓冲液，调节流数8mL/分钟。

2.将溶涨好的DEAE-Sephadex-A50宁较缓慢倒入层析柱中，使其自然沉积，待胶体积达20cm左右，

装柱完毕。

3.保持胶面到0.08M，pH7.0磷酸盐缓冲液的液面距离为3cm左右，安装层析柱上口螺旋。

4.调节流数为4ml/分钟，用0.08M，pH7.0磷酸盐缓冲液平衡层析柱，4小时或过夜。

（三）提取

1．每一大组（包含4小组）取牛心200g，去掉结缔组织，用预冷的生理盐水洗净血污，加pH7.4，0.05M 预冷的磷酸盐缓冲液400ml，充分匀浆，冰浴中搅拌2小时，双层纱布过滤。滤液4℃，10000rpm×30min 离心，取上清液，量体积，分为4组，以下每小组操作，留3ml样品测总蛋白和LDH活性。

2．第一次盐析：往上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，至25%饱和度。4℃放置4hr或过夜，充分盐析。次日4℃，14000rpm×30min离心；取上清，滤纸过滤，量体积，留3ml样品测总蛋白和LDH活性。

3．第二次盐析：在上述溶液中缓慢加入固体硫酸铵（20度，100%饱和度需硫酸铵619g/1000ml）（用量查表获得。），边加边搅拌，至50%饱和度。4℃放置4小时，4℃，14000rpm×30min，取沉淀，溶于5ml 0.08M(pH7.0) 预冷的磷酸盐缓冲液中。量体积，留3ml样品测总蛋白和LDH活性。

4．G-25脱盐：将上述磷酸盐溶解液4℃13000rpm×10min离心，除去沉淀，上清液1ml上G-25柱，用预冷0.08M磷酸盐缓冲液洗脱，280nm UV检测，分步收集（10分钟/管），合并第一个蛋白峰溶液，留3ml样品测总蛋白和LDH活性，-180C冷冻，冰冻干燥浓缩样品。

5．冰冻干燥浓缩的样品用纯水完全溶解（0.5-1ml），4℃，13000rpm×30min，去沉淀，为DEAE-Sephadex-A50柱层析上样样品。

（四）DEAE-Sephadex-A50柱分离纯化及活性鉴定

1．DEAE-Sephadex-A50柱进行分离纯化，上样量0.5ml，用预冷0.08M磷酸盐缓冲液洗脱。280nm UV 检测，分步收集（10分钟/管），有紫外吸收峰的组分分别混合，量体积，留3ml样品测总蛋白和酶活性，其余的冰冻干燥，取适量溶于水中进行PAGE或SDS-PAGE电泳。

2．DEAE-Sephadex-A50柱再生：用1M Nacl 溶液50mL洗柱，再用100ml0.08M磷酸盐缓冲液洗柱，回收凝胶。

3．总蛋白含量测定：用不同浓度的牛血清白蛋白作标准曲线，测各留取样品的蛋白质浓度和含量。

4．LDH酶活力单位测定：用不同浓度的丙酮酸溶液作标准曲线。通过原理中所叙述的反应，根据单位时间内所生成丙酮酸的量来测定LDH的酶活性单位（即37℃，每30min催化生成1μmol的丙酮酸所需要的酶量为一个活力单位）。反应操作过程如下：

空白管测定管

留样液

0.08M磷酸盐缓冲液底物溶液0

30μl

3ml

30μl

3ml