第二章_微生物的纯培养和显微技术

一、无菌技术
无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物
时防止其被其它微生物污染的技术。 它是保证微生物学研究正常进行的关键.
➢用于分离、培养微生物的器具事先不含任 何微生物 ➢在转接、培养微生物时防止其他微生物的 污染
第一节 微生物的分离和纯培养 一、无菌技术
1·1 微生物培养的常用器具及灭菌
常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等器皿 培养基：培养微生物的营养物质。
1. 涂布平板法
先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌 平板；
将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板 表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整 个平板表面；
经培养后挑取单个菌落；
2、稀释倒平板法（倾注平板法）（pour plate method)
二、用固体培养基分离纯培养 纯种微生物的分离方法
2. 稀释倒平板法
稀释：先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释 （如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......）；
倒平板：然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷 却至50℃左右的琼脂培养基混匀后，倾入灭过菌的培 养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板；
第二章
微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术
微生物的分离和纯培养 显微镜和显微技术 显微镜下的微生物
混合培养物
培养物（培cu养ltu物re）：在微生物学中，在人为规
定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体
纯培养物（pure culture）纯：培只有养一物种微生物的
培养物
纯培养能较好地得到重复结果 ， 是微生物研究的重要技术之一
1、所用物品的灭菌技术
A、玻璃或金属器皿灭菌 高温干热灭菌：干燥箱 160－170℃干热空气2h灭菌 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅 121℃湿热灭菌30min
B、培养基或溶液的灭菌
湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅 121℃湿热灭菌30min
C、血清或生长因子溶液灭菌 过滤除菌：细菌滤器
除菌过滤器采用孔径分布均匀 的微孔滤膜作过滤材料，为保证 阻止细菌和细菌孢子通过滤器， 滤膜的孔径一般不超过22μm， 小于细菌细胞的大小。
二、用固体培养基分离纯培养
酵母菌菌落
湿润、光滑 稠厚、不透明 边缘整齐 色调单一
四大类微生物菌落形态特征的比较
二、用固体培养基分离纯培养
纯种微生物的分离
自然界中，各种各样的微生物混杂在一起，要 研究和利用某一微生物，就必须把它同其他微 生物分开，才能得到只含有同一种微生物的纯 种微生物。这种方法叫纯种微生物的分离。
纯种平板分离的不同方法
104/ml
103/ml
102/ml
101/ml
从土壤中分离纯微生物
二、用固体培养基分离纯培养
纯种微生物的分离方法
稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法
1、涂布平板法（spread plate method)
涂布平板法 稀释倒平板法
二、用固体培养基分离纯培养
无菌操作台
超净台
超净工作台的工作原理 是利用鼓风机驱动空气 遁过高效滤器除去空气 中的尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空气徐 徐通过工作台面，使工 作台内构成无菌环境。
火焰旁无菌区
一、无菌技术
二、用固体培养基分离纯培养
菌落 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内
部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可 见的、有一定形态结构的子细胞群体，称 为菌落(colony)。
微生物纯种分离
将多种混杂微生物，经某种技术或方法 分离成纯种的过程
纯培养（pure culture）
在适宜条件下培养纯种获得的培养物 （群体）
第一节 微生物的分离和纯培养
1. 无菌技术 2. 用固体培养基分离纯培养 3. 用液体培养基分离纯培养 4. 单细胞（孢子）分离 5. 选择培养分离 6. 二元培养物
③ 福尔马林（40％甲醛液）：用于空间熏蒸 灭菌，加热或加高锰酸钾使其放出甲醛气 体。注意将空间密闭并维持24小时。
一、无菌技术
紫外线灭菌
用于接种室等空气灭菌。
2、接种
接种:将微生物接到适于它生长繁殖的人工培 养基上或活的生物体内的过程叫做接种.
无菌接种:培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的 工具在无菌条件下将含菌材料接种于培养基 上，这个过程叫做无菌接种。
平板：即培养平板（culture plate), 融化的 固体培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板， 用于分离、培养微生物。
二、用固体培养基分离纯培养
微生物纯种分离的原理和方法
微生物样品
分散成单个微生物
某种方法
培养
单菌落
多种混杂
平板
每个菌落为纯种（纯培养）
单菌落转接培养
纯种（纯培养）
二、用固体培养基分离纯培养
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一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养； 单个微生物只在固体培养基上形成菌落； 在液体培养基中不会形成菌落
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
菌落的大小、形状、边缘状况、质地、光泽、颜色 及透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。
细 菌 菌 落
菌落的形态是鉴定菌种的重要特征
放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干 燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面 时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落。
大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞 藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用 适宜的平板分离法很容易得到纯培养。
二、用固体培养基分离纯培养
培养平板（culture plate）
克隆（clone)：一个单细胞繁殖形成的菌落， 即一个纯种细胞群或克隆。
固体培养基：琼脂或其它凝胶物质固化的培养 基。
一、无菌技术
火焰灭菌：
对于接种针或其它金 属用具灭菌，可直接 在酒精灯火焰上烧至 红热。此外在接种过 程中，试管或三角瓶 口，也采取通过火焰 达到灭菌的目的。
一、无菌技术
药物灭菌：
① 70％的酒精：操作前手或器皿的表面杀菌， 载玻片，盖玻片的浸泡等。
② 1:1000 新洁尔灭溶液，浸泡时间为30分 钟，常用于表面的消毒。
涂布棒
弹簧接种枪
1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.接种锄 5.接种铲 6. 接种匙 7.接种刀 8.接种刀 9.剪刀 10.钢钩 11. 镊子 12.弹簧接种枪 13.接种、枪（日本式）
接种工具
接种环的灭菌
接种环烧红
接种环稍冷却
挑选单个菌落
划线
环境条件
1、实验台 2、空气
一、无菌技术