第七章-液相色谱

Sephadex 分为G10~G200, 型号命名: 溶胀率×10
• 琼脂糖系列
以β-D-半乳糖 和3,6-脱水-α L-半 乳糖为基本单位构 成的线性多糖。
琼脂糖系列又可分为两种牌号，由不 同产商生产。 （a） Bio-Gel A系 美国Bio Rad公司的产品，为交联琼脂 糖凝胶，适用pH值范围4～13。
（b） Sepharose系
Sepharose 非交联结构，仅能在2~40℃ 使用 ，琼脂糖含量为2% ,4% ,6%的产品命名为2B、 4B、6B。 Sepharose CL 利用环氧氯丙烷交联制备的琼 脂糖凝胶机械强度较高，可高温灭菌。 Superose 珠状琼脂糖经过两次交联，凝胶稳 定性加强。 Sepharose Fast Flow 高度交联的琼脂糖珠， 机械性能强，流速快
7.1色谱原理与分类
原理
层析是根据混合物中，溶质在互不混溶的两相 之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而 进行分离的方法。
互不混溶的两相分别称为固定相和流动相。
固定相填充于柱中，在柱的顶端加入一定量的料液后， 连续输入流动相，料液中的溶质在流动相和固定相之 间发生扩散传质，产生分配平衡。分配系数大的溶质 在固定相上存在的几率大，随流动相移动的速度小。 这样溶质之间由于移动速度的不同而得到分离。
• 洗脱方式
• 线性梯度
• 阶梯洗脱（逐次洗脱） • 一般最后都需高浓度盐溶液洗脱，以去除比目标 溶质结合更牢固的物质，以保证介质的吸附容量。
•
应用 要用于蛋白质等生物产品的浓缩和纯化。应 用十分广泛。 特点：
1. 料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下 操作； 2. 应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离 的选择性，所需柱长较短； 3. 产品回收率高； 4. 商品化的离子交换介质种类多，选择余地大，价 格较低。 5. 影响因素较多，过程设计和规模放大问题较多， 放大时需进行探索性实验。
缺点：
• 仅根据分子量大小差别进行分离，选择性低，处理量小 • 洗脱后，产品被稀释。
• 柱的装填
蛋白分级分离用的凝胶柱要有 一定长度，一般高于50cm，实验室 分离时柱高可为柱直径的20～40倍。 凝胶柱的装填直接影响到分离 效果，装柱时应一次性完成，并且 防止气泡产生。 装柱后，可用1%丙酮进行柱效 测定； 采用2mg/ml的蓝色葡聚糖溶液 检查层析柱的均匀性。
• 7.2 色谱过程理论基础
• 平衡模型 粗略。认为溶质在固定相和流动相中的分配平衡均瞬间完 成，柱内任意位置都达到平衡。 • 理论板模型 更切合实际，（但只适用浓度低的情况）。分配平衡需要 一定柱高才能完成。达到一次分配平衡的层析柱段称为一 个理论板，该柱段的高度称为理论板当量高度。理论板数 越多，洗脱峰越窄，溶质之间的分离程度越好。增加柱长， 可提高分离效果。
• 聚丙烯酰胺系
商品型号为Biogel-P（美国Bio-rad），是由丙烯酰胺 与N, N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚而成的一类亲水性凝胶 。
• 凝胶特性参数
• 排阻极限：指不能扩散到凝胶网格内部的最小分子的相对 分子质量。相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝 胶网格中，不能有效分离，洗脱体积为V0。 • 分级范围：能为凝胶阻滞且相互间可以得到分离的溶质的 相对分子质量范围。 • 溶胀率：干胶颗粒用水进行溶胀处理，每克干凝胶所吸收 水分的百分数称为溶胀率。
• 主要用于分离分子量低于5000，特别是1000以下 的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋 白质等，但介质和溶剂易使其在分离过程中失活。 • 疏水性越大的溶质，分配系数越大。流动相的极 性越大，溶质的分配系数越大。因此，多采用降 低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱。 • 最常用的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅 胶表面键合非极性分子层制备。C4, C8, C18, 或 苯基，c18的最多。其次c8和c4。 • 最常用的分析方法。分离效率高，性能稳定。介 质强度好。 • 硅胶分离，工业也常用。
下标1和2分别代表两个前后相邻的洗脱峰。 因此，分离度是两个相邻洗脱峰之间的距离与两 个峰宽的代数平均值之比。
R在1～1.5即可认为两物质间实现了良好的色 谱分离。
7.4凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography）
凝胶过滤层析也称体积排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）。一般利用凝胶 粒子（通常称为凝胶过滤介质）为固定相，根据料 液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析 法。
• 大分子不能进入凝胶中，只从床层空隙流过，洗脱体 积为层析柱的空隙体积V0。
• 小分子能进入凝胶所有细孔中，其洗脱体积接近柱体 积Vt。
• 其它分子洗脱体积介于V0和Vt之间。 • 且一种凝胶只能对介于V0和Vt之间的分子进行分离。
• 料液处理量很小。当料液体积小于两种溶质的洗脱体 积差时，两种溶质才能得到完全分离。
• 床体积：即1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。可用于估算 装满一定体积的层析柱所需的干燥凝胶量。 • 空隙体积：指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即V0。空隙 体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使 用相对分子质量为2000KD的水溶性蓝色葡聚糖。 商品化的凝胶，厂商目录中一般提供各种性质，例如 分级范围、粒径、流速和压力关系等，可参考使用。
7.9 羟基磷灰石色谱
羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)是一种磷酸 钙晶体，基本分子结构为Ca10(PO4)6(OH)2。利用 HAP的片状晶体颗粒为固定相分离纯化蛋白质的 液相色谱技术最早由Tiselius等于1956年提出， 1970年以后取得迅速发展。
7.5 离子交换色谱 ion exchange chromatography, IEC
• 利用离子交换介质为固定相，根据荷电溶质和离 子交换介质之间的静电相互作用力的差别进行溶 质分离的洗脱层析法。不同溶质在离子交换介质 上的分配行为不同，可以在洗脱过程中彼此得到 分离。
• 介质
• 常用于蛋白分离的离子交换基团有阴离子DEAE （二乙胺乙基，适用范围pH<8.6），QAE（季铵 乙基）；阳离子CM（羧甲基，适用范围pH>4）， 一般由凝胶过滤介质键合上述离子交换基，制得 相应的离子交换剂。
溶胀率 溶胀处理后质量－干燥 质量 100% 干燥质量
• 凝胶粒径：一般为球形，粒径大小对分离度有重要影响。 粒径越小，理论塔板高度越小，分离效率越高。一般用筛 目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50～150μm （100～200目），硬凝胶粒径较小，一般为5～50 μm。粒 径越小，操作压降越高。
• 色谱介质要求：
– 亲水性高，表面惰性；介质与溶质之间不发生 化学和物理相互作用。 – 稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化 学试剂中保持稳定，使用寿命长； – 具有一定的孔径分布范围，即孔径分布范围窄； – 机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。
• 葡聚糖系列（Sephadex）
Sephadex是由葡聚糖（由葡萄糖经α-1,6糖苷键 连接而成的线性高分子）经环氧氯丙烷交联而成的 珠状凝胶。 交联度越高，凝胶孔径越小。
第7章 液相色谱
7.1 色谱原理与分类 7.2 色谱过程理论基础 7.3 分离度 7.4 凝胶过滤色谱 7.5 离子交换色谱 7.6 疏水性相互作用色谱 7.7 色谱聚焦 7.8 反相色谱 7.9 羟基磷灰石色谱 7.10 超临界流体色谱 7.11 流通色谱 7.12 置换色谱
• 色谱（chromatography） 色谱又称层析，在英文中只有一个名 词Chromatography。现在趋向于统 一使用色谱这个名词，有些应用（蛋 白质分离）仍习惯使用层析。 1903年，俄国植物学家Tswett向填充 碳酸钙的柱中注入植物色素的石油醚 萃取物，然后用石油醚冲洗，发现柱 中出现数条相互分离的色带，层析的 命名就是由此发现开始的。
• 影响分离特性的因素
• 线速度：流速增大会提高理论塔板当量高度，降低分离效 果。 • 料液体积：与分离度有关，一般在不影响分离度的情况下 取最大值。
• 料液浓度：由于与流动相的粘度差，料液浓度高时洗脱曲 线容易出现不对称性质。
• 分子量与分配系数的关系：选择分级范围相对较小的介质， 可提高分离度和处理量。 • 凝胶粒径：粒径越小，理论塔板当量高度越小。高效液相 介质粒径小的原因。可提高操作流速，但介质需耐压。
在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏 水部位的水化层被破坏，裸露出疏水部位，疏水 性相互作用增大。所以，蛋白质在疏水性吸附剂 上的分配系数随流动相盐浓度（离子强度）的提 高而增大。因此，与离子交换不同，蛋白质的吸 附需在高浓度盐溶液中进行，洗脱则主要采用降 低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱 法。
A
浓 度
B
C
D
时间（或流出液体积）
色谱柱出口处溶质浓度变化（洗脱曲线）
• 分类
• 流动相与固定相
气相色谱法、液相色谱法、超临界流体色谱法
• 固定相的形状
液相色谱：纸色谱、薄层色谱、柱色谱
Hale Waihona Puke Baidu
• 分配机理
凝胶过滤层析，离子交换层析，疏水性层析，反相层析，亲和层析…
• 压力
低压（压力低于0.5MPa），中压（压力为0.5～4MPa），高压（压力 4～40MPa） 蛋白质分离一般为中低压，介质相对较软，分析多用高压层析，介质 多为硬质硅胶等。
盐析蛋白沉淀 疏水层析 √ 离子交换 ×
7.7 色谱聚焦
chromatofocusing
• 基于离子交换的原理，根据两性电解质分子间等 电点的差别进行分离纯化的洗脱层析法。可用于 蛋白质、多肽、核酸等分离纯化。
• 色谱聚焦是在色谱柱中形成连续的pH梯度，使料 液中的溶质依据各自的等电点或者吸附或者脱附， 逐次向下移动，彼此之间得到分离。
7.8 反相色谱 (reversed-phase chromatography)
• 利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂 的水溶液为流动相，根据溶质极性（疏水性）的 差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。与HIC同 样，RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固 定相表面。但RPC固定相表面完全被非极性基团 所覆盖，表现强烈的疏水性。因此，必需用极性 有机溶剂（如甲醇、乙腈等）或其水溶液进行溶 质的洗脱分离。
应用及特点
• 分离纯化：因处理量小，用于较靠后的步骤。
• 脱盐： 一般选用Sephadex G25，脱盐柱一般较短，上样量较 大，可为床体积的15～20%，最高甚至可达30%，而且凝 胶过滤速度快。 • 测定相对分子质量：蛋白分子量测定。
优点：
• 恒定洗脱法洗脱，操作条件温和，产品收率高 • 每批操作结束不需进行介质清洗和再生，容易实施循环操 作，提高产品纯度 • 脱盐手段，比透析法速度快，精度高；比超滤法剪切力小， 蛋白活性收率高 • 分离机理简单，操作参数少。
•
7.6 疏水性相互作用色谱
(hydrophobic interaction chromatography, HIC) 利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏 水性吸附剂为固定相，是根据蛋白质与疏水性介 质之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质生 物大分子分离纯化的洗脱层析法。
蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，疏 水性氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸等）含量较多 的蛋白质疏水性基团多，疏水性也大。尽管在水 溶液中蛋白质具有将疏水性基团的疏水基团折叠 在分子内部而表面显露极性和荷电基团的作用， 但总有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴 露在蛋白质表面。这部分疏水基团可与固定相 （亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等） 表面的弱疏水基发生疏水性相互作用，被固定相 所吸附。
• 传质速率模型 适用浓度较高的情况，有轴向返混的情况。降低流速，减 小介质粒径，可提高理论板数，即提高分离效果。但降低 流速会增加时间，减小粒径会增加操作压力。
• 7.3分离度（resolution）
分离度（分辨率） 表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程 度。分离度随理论板数的增加而增大。
2( R 2 R1 ) Rs W1 W2