质粒DNA的分离、纯化和鉴定
质粒DNA的提取和纯化
质粒DNA的提取和纯化一、实验目的掌握碱法小量提取质粒DNA。
二、实验内容质粒DNA的小量提取。
三、实验原理所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。
碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。
离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。
四、实验方法与步骤㈠细菌培养和收集将带有pUC19质粒的大肠杆菌接种在LB固体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃培养12～24小时。
在超净工作台中用无菌的牙签挑取平板培养基上的单菌落接种到25ml LB液体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃振荡培养（220rpm）约18小时至对数生长后期（OD600=0.6）。
㈡碱法小量提取质粒DNA1、将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，于4℃12000rpm离心30秒，弃去上清液，将剩余的培养物贮存于4℃。
重复3次，以得到较多的细菌沉淀（视具体情况而定）。
2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、加入100μl用冰预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴2～5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴2～5分钟。
6、4℃,12000rpm离心10分钟。
将上清液转入另一只1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟。
质粒dna提取原理
质粒dna提取原理
质粒DNA提取原理是通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构，释
放质粒DNA，并利用化学方法提取纯化质粒DNA。
质粒DNA提取的步骤如下：
1. 细胞裂解：将细菌培养物经过离心，得到菌体沉淀，然后加入裂解缓冲液，破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
2. 质粒DNA纯化：加入一定量的碱性溶液，使细菌染色体DNA变性沉淀，而质粒DNA仍溶于溶液中。
然后通过离心，将质粒DNA沉淀下来。
3. 质粒DNA沉淀：将溶液中的质粒DNA与乙醇混合，使质
粒DNA沉淀成片状。
通过离心，得到质粒DNA沉淀。
4. 质粒DNA溶解：将质粒DNA沉淀洗涤去除杂质，并用适
当的缓冲液将质粒DNA溶解，得到高浓度的质粒DNA。
质粒DNA提取的关键在于破坏细菌细胞结构，释放质粒DNA，然后利用沉淀和溶解等步骤进行纯化。
通过以上步骤，可以提取到纯化后的质粒DNA，用于后续实验或分析。
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
质粒DNA的提取及检测实验报告
题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
二．实验原理1. 质粒 (Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。
2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。
目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
3.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。
4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0)作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。
大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
实验六 质粒DNA的分离、纯化和鉴定
三、材料
含质粒的E. coli DH5α 系列菌株， 1.5ml的eppendorf管，离心管架。 微量取液器(20μ l，200μ l，1000μ l)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸 汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电泳 仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。
四Hale Waihona Puke 试剂1. LB固体和液体培养基： 2. 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc· 2 O, 3H 用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存 于4℃冰箱。 3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高 压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。 4.溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液 稀释)，1％ SDS。 5.溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。 6. 氯仿:异戊醇（V/V)＝24:1。
五、操作步骤 1、取培养至对数生长后期的含质粒的大 肠杆菌培养液1ml，4℃下10000r/min离心1min, 弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀物重新悬浮于150µ L溶液I 中,充分混匀，在室温下放置5min。 3、加入200µ L新配制的溶液II, 盖紧管盖, 缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰 浴5min。 4、加150µ L用冰预冷的溶液III, 摇动离心 管数次以混匀内容物,冰上放置5min,此时应形 成白色絮状沉淀。
质粒DNA的提取及鉴定
二、实验原理
当pH=4.8的乙酸钾将其pH调到中性时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性， 形成缠绕的致密网状结构。同时，在反应体系中变性 的蛋白质会形成大量沉淀以及十二烷基磺酸钾沉淀， 染色体DNA会进一步缠绕在这些沉淀上。离心后，染 色体DNA与蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除 去，质粒DNA留在上清里。
水平电泳装置
四、实验操作
1、用碱裂解法提取质粒DNA：挑选单菌落小规模扩增后， 将2 mL含相应抗生素的 LB加入到容量为15 mL并通气良好的 试管中，然后接种入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜， 收集细菌。
2、将细菌团块重悬于100μL用冰预冷的溶液Ⅰ（150 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris–HCl，pH8．0，10 mmol/L EDTA， pH8.0）中剧烈振荡。加200μL新配制的溶 液Ⅱ(0.2mol/L Na0H, 1%SDS)盖紧管口，快速颠倒离心管5 次，将离心管放置于冰上。
3）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械 剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。
4）加入醋酸钾溶液后，可用小玻棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒 DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。溶解DNA，加入等体积 酚/氯仿抽提，取水相再用乙醇沉淀DNA。
四、实验操作
3、对提取的质粒DNA进行纯化及酶切鉴定： 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA，采用胶回收 试剂盒纯化质粒DNA；分析质粒DNA的限制 性酶切图谱，选择合适的限制性内切酶对质 粒DNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切 产物。
五、 结果处理
利用凝胶成像系统进行检测
闭环(螺旋) 闭环(超螺旋) 开环(部分解链 )
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard 法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
质粒DNA的提取、纯化及验证
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：2 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
质粒DNA的分离`纯化
对 策
混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA
不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 加入RNaseA室温放置一段时间 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。
碱裂解法流程图
对数期菌体
溶液III中和
溶液I充分重悬
溶液II裂解
上清液
抽提
离心洗涤
酒精沉淀
干燥溶解
沉淀
质粒DNA溶液
菌种 ：E. coli MV1184（含pUC118）、 E. coli K12（含pEGFP） 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：LB液体培养基 、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 、RNA酶A 、饱和酚:氯仿＝ 1:1
质粒DNA－煮沸法
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。
质粒DNA的提取纯化与鉴定_OK
1、制备1％琼脂糖凝胶：称取1 g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入
100mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇
匀。
2、胶板的制备
1） 选择适当大小干净的有机玻璃内槽，放好样品梳子。
2）将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，加入3-5μl EB储存液
（2mg/mL）摇匀，缓缓倒入有机玻璃制胶槽内，直至有机玻璃板
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三、质粒DNA的鉴定
（一）、紫外光谱分析
通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯 度。
（二）、EB荧光分析
（三）、电泳鉴定
在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与
分子量的对数值成反比关系。质粒DNA
经单一酶切后与DNA Marker进行电泳对
照，即可知该质粒的分子量大小。
10
质粒的电泳图谱
11
质粒DNA的鉴定和酶切分析
4. 应用：定点切割
17
酶切产生的末端
（1） ———G A T↓A T C——— ———C T A↑T A G——— EcoRⅤ酶切产生平端
———G A T ———C T AP
PA T C——— T A G———
（2） ———G↓A A T T C——— ———C T T A A↑G——— EcoRⅠ酶切产生5’突出粘端
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一般提取的质粒有3种构型：
➢超螺旋的共价闭合环状 ➢开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一 条链断裂 ➢线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两 条链都发生断裂。
通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其 中超螺旋质粒DNA泳动最快， 其次为线状DNA， 最慢的为开环质粒DNA。
14
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实验步骤
4、电泳
1）．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成
分子生物学常用实验技术(精)
分子生物学常用实验技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和 cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组 DNA 的提取第七章 RFLP和 RAPD 技术第八章聚合酶链式反应 (PCR扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector。
细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。
质粒 (Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子 , 大小从 1-200kb 不等 , 为双链、闭环的 DNA 分子 , 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力 , 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 , 并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活 , 而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 , 如对抗生素的抗性等。
F 质粒 (又称F 因子或性质粒、 R 质粒 (抗药性因子和 Col 质粒 (产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型 :紧密控制型 (Stringent control和松驰控制型 (Relaxed control 。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 , 当染色体不复制时 , 它也不能复制 , 通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子 , 如 F 因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制 , 在每个细胞中有许多拷贝 , 一般在 20个以上 , 如 Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时 , 细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制 , 紧密型质粒复制停止 , 而松驰型质粒继续复制 , 质粒拷贝数可由原来 20多个扩增至 1000-3000个 , 此时质粒 DNA 占总DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。
质粒DNA分离纯化
血球gdf55m白血球fd2），风马牛不相 及，从 理论上 讲就没 有结合 的可能 ，只是 形式上 的融合 罢了。 （df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6）
故出现西医对治疗不了的疾病只好求 助中医 ，而中 医则往 往采用 西医诊 断中医 治疗， 以及中 西治疗 法一块 用的局 面。
（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr ）至于 （45传 染病q566丙肝964jo乙 肝28jgs x甲肝gh）循 证医学 、比较 医学、 后现代 医学、 行为医 学等所 谓“医 学”， 都称不 上一门 独立的 医学科 学，关 于这一 点在灵 魂医学 有关章 节中将 有相关 点评。
实验结果:获得质粒DNA(pUC118及pEGFP)
四、注意事项──材料准备
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌 体导致开环质粒增加)
➢ 培养时应加入筛选压力,否则菌体易 污染,质粒易丢失
➢ 尽量选择高拷贝的质粒,如为低拷贝 或大质粒,则应加大菌体用量
➢ 菌株不要频繁转接(质粒丢失)
四、注意事项──细胞裂解
原 因
1. 菌体老化 2. 碱裂解不充分 3. 菌体中无质粒 4. 溶液使用不当
1. 请涂布平板培养后,重新挑选 新菌落进行液体培养
2. 可减少菌体用量或增加溶液 的用量
对
3. 不要频繁转接,每次接种时应 接种单菌落。检查抗生素使
策
用浓度是否正确。
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊,置于37℃保温片刻直 至溶解为清亮的溶液。
溶液Ⅰ:50mM 葡萄糖;25mM Tris·HCl(pH8.0);10mM EDTA 溶液Ⅱ:(新鲜配制)0.2N NaOH;1﹪ SDS 溶液Ⅲ:5M KAC 10ml;冰醋酸 11.5ml;水 28.5ml
第一章质粒DNA的分离,纯化和鉴定
第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
2021年分生实验报告质粒DNA的提取纯化与鉴定
试验四质粒DNA提取, 纯化与判定DNA体外重组技术【试验原理】是在分子水平上, 依据大家需要以人工方法取得感爱好目基因, 在体外与载体DNA分子重组, 然后将重组分子转入受体细胞, 并筛选出能表示重组DNA活细胞, 加以纯化、扩增, 成为克隆。
【试验步骤】1.分离或合成感爱好目基因及载体---分2.构建、改造作为载体DNA------------切3.目基因与载体DNA在体外重组--------接4.重组DNA引入受体细胞----------------转5.阳性重组子筛选、判定、扩增-------筛【注意事项】目基因取得:1.从染色体DNA中直接分离2.人工合成3.由mRNA逆转录合成cDNA4.从基因组文库中筛选目基因5.PCR取得载体选择:1.能在宿主细胞中独立复制, 并能携带重组DNA片段一同扩增;2.有适宜限制性酶切位点便于进行克隆;3.有一定筛选标识, 易于识别和筛选;4.载体分子应尽可能小, 可插入较大外源DNA而不影响复制;5.表示型载体应配置与宿主细胞相适应开启子、前导序列、增强子等调控元件;6.生物安全性好。
质粒DNA提取【试验原理】质粒是细胞质中独立于染色体之外能自主复制遗传单位。
基因工程中质粒通常是指细菌质粒, 它能够伴随细菌细胞分裂将自己遗传特征稳定遗传给后代细胞。
质粒中除了复制、转录等相关必需序列外, 有部分DNA区段对于细菌来说并非必需序列, 经过体外操作以目基因替换这些非必需区段, 这种改造质粒就成为外源基因载体。
根据质粒载体用途和其外源DNA遗传信息能否表示可分为中间克隆载体（如pMD18-T）和表示载体（如pET-X、 pBI121等）。
克隆载体所连接DNA片段通常没有开启子, 所以不能转录, 关键用于目片段大量制备。
表示载体根据宿主不一样有多种多样原核表示载体（如大肠杆菌）和真核表示载体（如酵母、动物和植物）, 目基因在载体上有完整开启子和终止子调控, 能够在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。
质粒DNA的提取和鉴定
酶切鉴定
10μL溶液 + 10×内切酶缓冲液2μL + 5～10U酶
到一Eppendorf管 37 ℃，1-2h 加2μL的反应中止液。 电泳： 1. 1％Agrose gel的制备 2. 上样 3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照
思考题
染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？
参考答案
纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒
3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核 酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙 色荧光
一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活 化菌种），37℃过夜培养
2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升 液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜 培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap）， 37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）
二
质粒提取
1. 取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中， 12000r/min，4℃，30sec 2. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中， 剧烈振荡 4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧 Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物， 将Eppendorf管放在冰上
• 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素： 质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于
纯化的技术和实验要求
碱裂解法
基本原理：
1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋
白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质
粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离 心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复 性而呈絮状，离心时可沉淀下来
质粒DNA的分离与纯化t Word 文档
质粒DNA的分离与纯化吴乃虎（中国科学院遗传与发育研究所）黄美娟（北京大学生命科学学院细胞遗传学系）一. 导言1. 质粒DNA的分离应用质粒作为基因克隆的载体，—个重要的条件是要获得批量的纯化的质粒DNA 制剂。
通常所说的质粒DNA的制备，事实上包括质粒DNA的分离和质粒DNA纯化两个步骤或两个内容。
⑴质粒DNA的分离这是指应用溶菌酶或是十二烷硫酸钠(SDS)处理大肠杆菌寄主细胞，使之完全裂解，释放出完整的染色体DNA及质粒DNA。
在这个步骤，要求操作十分温和而小心谨慎，要尽量避免染色体DNA发生断裂。
大肠杆菌细胞裂解液经离心之后，获得了含有大量质粒DNA的上清液。
⑵质粒DNA的纯化在离心所得的大肠杆菌细胞裂解液上清液中，不可避免地含有寄主细胞染色体DNA 短片段，因此需要设法除去这些污染的DNA片段，使质粒DNA得以纯化出来。
2. 选择制备质粒DNA技术程序必须考虑的因素己经发展出了许多种用于制备质粒DNA的快速简易的方法。
针对不同的具体实验的对象，究竟应选择何种技术程序，主要应考虑如下这些因素：⑴所研究的目的质粒DNA分子量的大小；⑵实验程序要尽可能简单，並有良好的重复性；⑶要使用溶菌酶溶菌的细菌种属，以及溶菌酶以外的其它溶菌药剂；⑷实验方法要温和，如果是制备大分子量的质粒DNA，这点尤其要重视；⑸质粒DNA的产量(这点与质粒拷贝数密切相关)；⑹提取质粒DNA的实验用途，例如供作限制酶酶切分析，或是进行转化实验等。
3. RNA及蛋白质等污染物的去除对于—般的转化实验以及克隆过程，并不—定需要制备纯化的质粒DNA。
但是为了构建限制性酶切图谱，为了获得发表用的图片，以及—些特定的克隆程序等，则需要制备纯化的货粒DNA。
为此需要在质粒DNA纯化过程中加RNase处理以除去RNA，用酚抽取除去蛋白质，或是加入核酸酶抑制剂：焦碳酸二乙酯，以除去—些菌种中存在内源核酸酶。
二. 微量碱法制备质粒DNA1. 溶液配制（1）Solution 1[ 50mM Glucose,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA]Glucose 991.0mg2M Tris-HCl(pH 8.0) 1.25ml0.5M EDTA (pH 8.0) 2.0mlLysozyme 4mg/mlG.D.H2o --------→ 100a.Autoclaved for 15 mins at 10 b/in2 and stored at 40C。
质粒DNA的提取和鉴定
该技术通常具有快速、高效的特 性，能在短时间内处理大量样本。
高通量质粒DNA提取技术可以提 供标准化的操作流程，确保提取 的一致性和准确性。
质粒DNA的测序技术
下一代测序
质粒DNA的测序技术已发展到下一代测序 阶段，能够快速、准确地测定质粒DNA的 全序列。
深度覆盖
通过深度覆盖测序，可以获得质粒DNA更全面的序 列信息，有助于发现稀有变异和基因组结构变异。
注意事项
凝胶电泳检测质粒DNA时，需要注意电泳条件的选择，如电压、电流和时间等，以确保 分离效果最佳。同时，需要使用已知大小的DNA片段作为标准进行对比分析。
紫外分光光度法检测质粒DNA
01
原理
紫外分光光度法是通过测量物质在特定波长下的吸光度来分析物质浓度
的方法。质粒DNA在260nm波长下有最大吸收峰，通过测量吸光度可
基因组编辑
质粒DNA可以作为CRISPR-Cas9等基因组编辑技术的辅助工具，用于向细胞提 供指导编辑的RNA和Cas蛋白。通过将质粒导入细胞，可以实现对特定基因的敲 除、敲入或突变。
在生物技术和生物工程中的应用
生物制药
质粒DNA常被用于生产重组蛋白药物，如胰岛素、生长激素 等。通过在大规模细胞培养物中转染质粒，可以高效地生产 这些药物。
质粒DNA提取的注意事项
保证细菌的活性和纯度
在提取前应确保细菌处于对数生长期，并去除杂质和死细胞。
避免交叉污染
整个操作过程需在无菌条件下进行，并确保使用的工具和试剂无菌。
保证质粒的完整性
提取过程中应避免质粒断裂或降解，以确保后续实验的准确性。
02
质粒DNA的纯化
离心法纯化质粒DNA
原理
通过高速离心将质粒DNA与细 胞碎片、蛋白质等杂质分离，
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第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而捾驰压褨碒竧竭复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。
质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。
常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。
在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。
如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
第二节材料、设备及试剂一、材料含pBS的E. coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。
二、设备微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
三、试剂1、LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。
3、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成50mg/ml水溶液, -20℃保存备用。
4、溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。
5、3mol/l NaAc (pH5.2)：50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。
6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。
溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1％SDS。
8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。
溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。
冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。
重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
11、氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。
氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。
酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
12、TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。
高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)，5% Triton X-100。
14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
15、电泳所用试剂：（1）TBE 缓冲液(5×)：称取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。
（2）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。
第三节操作步骤一、细菌的培养和收集将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。
用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
二、质粒DNA少量快速提取质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。
这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
（一）、煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意]1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。
（二）、碱法1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。
6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。