微生物菌种资源的的分离纯化

如何根据不同微生物种类对生态环境的不同要求以及不同的营养要求指导微生物菌种资源的的分离纯化？请举出1个应用实例。

首先分析筛选菌种的生态分布状况，以减少采样工作的盲目性。土壤是自然界微生物生活的大本营，土壤一般都是首选的采样目标；采样地点选好后，先除去表土，取离地面5—20cm深处的土样约数十克，盛入事先灭过菌的牛皮纸袋或塑料袋等容器中，并记录样品的编号、采样时间、地点、立地条件、植被情况等。采到的样品应尽快带回实验室内使用。若暂时不能分离使用，应置冰箱中保存。

各种天然生境中的微生物群体实质上是一种混合培养物，其中的目标菌可能非常少，因此需要设计一些方法把需要的目标微生物从混合的微生物群体分离出来或者使其丰度提高。常用的方法是选择性培养和富集培养。

选择性培养：提供一个特别设计的培养环境，以有利于所要分离的微生物的生长，而不适于其它微生物的生长。

富集培养：在培养中，通过添加某些特殊营养物质或控制培养条件，使本来数量极少的待筛选微生物丰度提高，从而增加其分离几率的培养方法称为富集培养。

富集培养本质上和选择性培养无很大差异，可以认为是选择性培养的一种类型。如果经一次富集培养后该微生物数量还太少，则可根据需要进行多次富集培养，直至达到可进行稀释分离的程度为止。

分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或单一微生物克隆（菌株）的过程。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法、平板划线法。

微生物的性能测定：分离得到纯种微生物，只是选种工作的第一步。所得到的纯种是否具有符合生产或科研要求的性能，还必须通过测定才能知道。性能测定的方法一般分初测和复测。主要的有培养特性测定、酶活性测定、产孢性能测定、次生代谢产物产生量测定等。具体方法包括透明圈测定、最适培养温度、需氧测定，最适pH条件测定等。

不同的微生物种类，对生态环境的要求和营养需要是不同的，在分离纯化微生物时，应该根据它的生活习性进行，选择合适的分离方法，达到纯化目的。一般常用的分离方法包括如下几种：

1、用固体培养基分离和纯化

单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。固体培养基分离方法又分为稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法、稀释摇管法。

2、用液体培养基分离和纯化

大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。

稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。

3、单细胞（孢子）分离

只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类是稀释法的一个重要缺点。在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。

较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。

4、选择培养分离

如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，特别适用于从自然界中分离、寻找有用的微生物。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离，包括利用选择平板进行直接分离、富集培养。

例如对大肠杆菌的分离纯化，就主要采用平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线，大肠杆菌细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，细胞能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。首先烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷后取菌作连续划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，以同样方法作几次划线，将平板表面划完。划线完毕，盖上平皿盖，做好标记，置37℃孵育培养24小时后观察结果。常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。一两天以后，长出白色的单菌落，用枪头挑取合适的菌落（以中、小形菌落为主）进行接种，以便进行后续实验。