蛋白质的表达、分离、纯化实验流程
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
蛋白纯化步骤
蛋白纯化步骤引言：蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。
为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。
一、细胞裂解和收集蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。
常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。
裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。
二、沉淀和上清液分离细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。
常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。
这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。
三、蛋白质分子量筛选蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。
这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。
常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。
四、亲和纯化亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。
亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。
通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。
五、离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。
根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。
通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。
六、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。
通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。
这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。
七、逆流层析逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。
该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。
通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。
蛋白质的表达纯化
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
蛋白质的表达纯化
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
蛋白质的表达纯化
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
• 3. 细胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流 出液。
• 4.洗脱杂蛋白：用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱， 分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。
• 5.洗脱目标蛋白：用10mL洗脱缓冲液洗柱，每管0.5－1 mL， 共收集6－10管，分别取1蛋0白u质l样的表品达纯用化于SDS-PAGE 分析。
蛋白质的表达纯化
实验步骤
• 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 • 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌
BL21菌株于5mL LB液体培养基中 （含100ug/mL 氨苄 青霉素），37℃震荡培养过夜。 • 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉 素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 • 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h. • 4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于20℃或-70℃冰箱中。
蛋白质的表达纯化
• 3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配
方如下：
30%Arc- Tris-HCl H2O
Bis
蛋白表达纯化的实验原理
蛋白表达纯化的实验原理蛋白表达与纯化是生物学实验中常用的技术，可以用来研究和生产各种蛋白质。
本文将一步一步回答关于蛋白表达纯化实验的原理和步骤。
第一步：蛋白表达系统的选择蛋白表达系统是指用来制备和表达目标蛋白质的细胞或病毒载体。
常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。
选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质、需求量和表达效率等因素。
第二步：构建表达载体表达载体是将目标蛋白的基因序列插入到细胞或病毒载体中，以实现蛋白表达的工具。
通常采用的方法是将目标基因通过限制性内切酶切割，然后与适当的载体连接。
第三步：细胞转染或感染将构建好的表达载体转染到细胞中，使目标蛋白基因在细胞内进行表达。
对于真核细胞（如哺乳动物细胞）可以通过转染的方式传递质粒DNA，而对于原核细胞（如大肠杆菌）可以通过热激转化或电穿孔等方法进行具体的转染。
第四步：培养表达细胞转染或感染后，需要将细胞培养到合适的条件下，以促进目标蛋白表达。
培养条件包括适宜的培养基、温度、氧气供应和营养物等。
此外，可以考虑添加特定的诱导剂或抑制剂，以调控蛋白表达的级别。
对于细菌目标蛋白表达，通常将细胞培养在含有抗生素的培养基上以选择表达带有目标基因的细菌。
第五步：蛋白表达检测为了确定目标蛋白是否在细胞中表达，可以使用多种方法进行检测。
常用的方法包括Western blot、ELISA、原位杂交、荧光染色等。
同时，可以通过调整培养条件或表达载体的构建来提高蛋白表达的水平。
第六步：蛋白纯化蛋白纯化是从表达系统中提取和纯化目标蛋白的过程。
纯化步骤的选择取决于目标蛋白的性质和所需的纯度。
常见的纯化方法包括亲和纯化、凝胶过滤、离子交换、大小排除层析、亲水性层析等。
此外，还可以使用亲和标签（如His标签、GST标签等）来辅助蛋白质的纯化。
第七步：蛋白质的鉴定和定量通过蛋白纯化后，需要对目标蛋白进行鉴定和定量。
可以使用SDS-PAGE、Western blot、质谱分析等方法来确定蛋白质的分子量和纯度。
蛋白质分离纯化设计
蛋白质分离纯化设计1. 简介蛋白质分离纯化是一项重要的实验技术，在生物医药、食品科学、农业等领域有着广泛的应用。
通过对蛋白质进行分离纯化，可以获得单一纯度的蛋白质用于后续研究及应用。
本文将详细介绍蛋白质分离纯化的设计方法和常用技术，包括样品准备、分离方法选择、纯化步骤设计等。
同时，我们还将讨论常见的挑战和解决方案，以及如何评估分离纯化效果。
2. 样品准备在进行蛋白质分离纯化前，首先需要准备好样品。
样品的选择和准备对于后续分离纯化过程非常重要。
2.1 选择合适的样品样品可以来自细胞、组织、体液、培养基等。
在选择样品时，需要考虑到蛋白质的种类、表达水平、目标纯化程度以及后续实验需要。
2.2 样品预处理样品在分离纯化前需要进行预处理，以去除可能干扰纯化过程的杂质。
常用的预处理方法包括细胞破碎、离心、除去非蛋白质成分等。
预处理方法的选择应根据样品类型和后续纯化方法进行优化。
3. 分离方法选择根据蛋白质分离的原理和样品特性，我们可以选择合适的分离方法。
常见的分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤、透析、亲和层析等。
3.1 离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质带电性质的分离方法。
可以根据蛋白质的以阴离子或阳离子带电来选择合适的离子交换树脂，实现不同蛋白质的分离纯化。
3.2 凝胶过滤凝胶过滤是一种基于蛋白质大小的分离方法。
通过选择适当的孔径大小的凝胶，可以分离不同分子大小的蛋白质。
3.3 透析透析是一种基于蛋白质分子量和溶液成分的分离方法。
通过选择适当的膜材料和透析缓冲溶液，可以实现蛋白质与小分子化合物的分离。
3.4 亲和层析亲和层析是一种基于蛋白质与配体之间的特异性结合来分离纯化的方法。
选择合适的亲和配体，可以选择性地结合目标蛋白质，从而实现其分离纯化。
4. 纯化步骤设计在选择合适的分离方法后，需要设计纯化步骤来实现目标蛋白质的分离和纯化。
纯化步骤的设计应根据分离方法的特点和目标蛋白质的性质进行优化。
4.1 样品加载将预处理的样品通过适当的装载方式加载到分离纯化柱中，如使用注射器将样品缓慢注入。
trna结合蛋白质的分离,纯化和鉴定
trna结合蛋白质的分离,纯化和鉴定
TRNA结合蛋白质的分离、纯化和鉴定是一个复杂的过程，需要涉及许多技术和实验步骤。
以下是一般的实验流程：
1. 细胞培养和TRNA结合蛋白质提取：首先，需要选择一种可供TRNA结合蛋白表达的细胞。
表达TRNA结合蛋白的细胞可以通过病毒转染、质粒转染或基因编辑等方法获得。
然后，需要经过一系列的细胞培养、细胞裂解和蛋白质提取的步骤，获得含有TRNA结合蛋白的蛋白提取物。
2. 蛋白质组学分析：使用蛋白质组学技术如SDS-PAGE、2D-PAGE等，可以对提取物进行蛋白质分析，并定位TRNA结合蛋白的位置。
3. 亲和层析纯化：从蛋白提取物中纯化TRNA结合蛋白，可以使用亲和柱层析技术。
通常，这种方法是基于TRNA分子与TRNA结合蛋白具有特异性相互作用的原理，通过对纯化物进行一系列精简的层析、洗脱和再结晶等步骤，纯化出TRNA结合蛋白。
4. 电泳分离和氨基酸测定：用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对纯化的TRNA结合蛋白进行分离。
分离出的蛋白质可以通过氨基酸测定，获得每个氨基酸残基的位置和序列。
5. 质谱分析：使用质谱技术，可以用于分析TRNA结合蛋白的完整的序列和特
定结构。
通过使用MALDI-TOF质谱、毒蕈碱胶板电泳或其他质谱技术，可以得到蛋白质的分子质量、残基序列等信息。
6. 功能分析：最后，通过功能实验，可以确定TRNA结合蛋白通过哪些方式与其靶标mRNA或其他蛋白分子相互作用，并参与哪些细胞生物学或生物化学过程中。
蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件讲解学习
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
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当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
玻璃匀浆机
b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相 互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可 达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于 动物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA。
2、设计蛋白表达引物.引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA。
4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3）、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。
6左右,加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3）将有表达的菌株10％甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0。
22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%—60％，使用时自己计算用量.4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm)，诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：1。
如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达.葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。
2。
保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌.1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度，300rpm摇至OD〉=1.5,约5h左右，视菌种的活性而异,也可过夜摇菌.2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。
）注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
蛋白质纯化实验步骤
蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。
下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。
一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。
样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。
二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。
离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。
三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。
可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。
这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。
四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。
五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。
凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。
六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。
柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。
七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。
透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。
八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。
常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。
九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。
蛋白质表达与纯化步骤
蛋白质表达与纯化步骤一、蛋白质表达的那些事儿蛋白质表达就像是一场神奇的魔法秀，要让小小的基因变成实实在在的蛋白质呢。
咱先得从基因开始说起。
基因就像是一个藏着宝藏密码的小纸条，我们要把这个密码找出来，然后送到一个特殊的“工厂”里，这个“工厂”就是细胞啦。
在细胞这个“大工厂”里，有各种各样的“小工人”，也就是各种酶和分子机器。
我们要把基因送到细胞里，就像是把宝藏密码送到工厂里一样。
不过这可不是随随便便就能送进去的，得用一些特殊的方法，就像你要进一个很严格的地方得有通行证一样。
比如说，我们可以用一些载体，这些载体就像是小飞船，带着基因这个“乘客”进入细胞。
而且呀，不同的细胞就像不同的工厂，有的擅长生产这种蛋白质，有的擅长生产那种蛋白质。
所以我们得挑选合适的细胞。
要是选错了细胞，就可能像把做蛋糕的配方送到做鞋子的工厂一样，完全不对路嘛。
1. 基因的准备我们得先把想要表达的基因从它原来的地方给找出来。
这有时候就像在一个超级大的图书馆里找一本特定的书一样难。
我们可能得用一些特殊的工具，像是限制酶，它就像一把小剪刀，可以把基因从长长的DNA链上准确地剪下来。
然后我们还得把基因整理得干干净净的，不能有其他乱七八糟的东西混在里面，就像我们要把书擦干净，不能有灰尘一样。
2. 载体的选择载体的种类可多啦。
有质粒载体，它就像一个小小的环状“快递盒”，可以把基因装在里面。
还有病毒载体，这就更酷了，就像用一个小病毒来当快递员，不过这个病毒是经过我们改造的，不会让人生病的哦。
选择载体的时候，我们要考虑很多东西，比如这个载体能不能在我们选定的细胞里生存呀，它能装多少基因呀，就像我们选快递盒的时候要考虑大小和能不能送到目的地一样。
二、蛋白质纯化的趣味之旅当蛋白质在细胞里被表达出来后，就像一堆宝贝混在沙子里一样，我们得把蛋白质这个宝贝给挑出来，这就是蛋白质纯化啦。
这可不容易呢，因为细胞里有各种各样的东西，有其他的蛋白质，有核酸，还有各种小分子。
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程2010年02月27日星期六09:02丁香园chrispp作品。
一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h （大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h。
4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图11:pET-32aA3未诱导，2:pET-32aA3未诱导，3:pET-32aA3诱导后，4:pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。
2、将重悬于0.9%NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9%NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA 出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图21:pET-32aA3诱导上清，2:pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
实验步骤一：材料准备1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒二：实验操作1.试剂准备：2.2. 获得目的基因①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
3. 构建重组表达载体①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
4. 获得含重组表达质粒的表达菌种①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。
5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。
②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。
重组蛋白分离纯化的流程
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蛋白质分离纯化的步骤
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
（―）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
蛋白质的表达纯化及结晶
2.3.2.2 蛋白质表达、纯化（1）初始种子培养：挑取阳性克隆到10 mL的含有Amp抗生素的液体LB培养基中，在37℃过夜振荡培养。
（2）扩大培养：将初始种子接入1 L含抗生素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌浓OD600为0.6-0.8时，降温至15℃或20℃；一个小时后加入终浓度为0.6 mM的IPTG，并诱导表达过夜。
（3）收集菌体：于4200 rpm，4℃下离心15 min，弃去上清，收获菌体；加入重悬溶液（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl），悬浮菌体细胞；细胞破碎前加入终浓度为2 mM的蛋白酶抑制剂PMSF（Phenylmethyl sulfonyl fluoride，苯甲酸磺酰氟）。
（4）超声破碎细胞：400W下，超声3s，间隔6s，工作60次。
（5）超速离心：细胞裂解液于14000 rpm，4℃下离心50 min，收集上清液，进行下一步的分离纯化。
（6）Ni-NTA亲和层析：将上清液体倒入Ni-NTA柱中。
流净后，用wash buffer （25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，15 mM imidazole）冲洗10个柱体积，除去杂蛋白；最后使用elution buffer（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，250 mM imidazole）将目的蛋白洗脱下来。
使用SDS-PAGE检测蛋白的可溶性、挂柱效率及蛋白的浓度。
由于本实验中YdiV等蛋白都是连接到pGl01载体中，带有可以用PPase切除的6×His标签。
为了获得更纯净的、不带标签的蛋白，我们在有那个wash buffer冲洗去除杂蛋白以后，每根镍柱中加入5 ml的重悬缓冲液然后加入100-200 μL的PPase，3-5 h后，用5 ml重选冲洗柱子，电泳检测酶切效率。
（7）阴离子交换层析纯化：先平衡离子交换柱。
然后将上一步洗脱下的蛋白用溶液A（25 mM Tris-HCl, pH8.0）稀释4-6倍，上样到离子交换柱Source Q上，使用溶液A与溶液B（25mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl）进行线性梯度洗脱。
蛋白质提取纯化的基本流程
蛋白质是生物体内一类非常重要的大分子有机化合物，承担着多种生物学功能。
为了进行蛋白质的研究、分析或应用，科学家们需要从复杂的生物体系中提取和纯化目标蛋白质。
蛋白质提取纯化的基本流程通常包括样品制备、裂解、离心、层析、电泳等步骤。
下面是关于蛋白质提取纯化的基本流程的详细解释：### **1. 样品制备：**蛋白质提取纯化的第一步是样品的制备。
这涉及到从生物体（细胞、组织等）中获得样品。
样品的制备过程中要注意避免蛋白质的降解和损失。
常见的样品包括细胞总蛋白、细胞膜蛋白、细胞器蛋白等。
制备好的样品需要储存在低温下以防止蛋白质的降解。
### **2. 裂解（细胞破碎）：**样品制备完成后，下一步是裂解，也就是将生物体内的细胞或组织破碎，释放蛋白质。
裂解可以通过机械破碎、超声波破碎、高压破碎等方法实现。
同时，可以添加裂解缓冲液，其中可能包含蛋白酶抑制剂、还原剂等，以维持蛋白质的稳定性。
### **3. 离心：**裂解后的混合物通过离心可以分离成上清液和沉淀。
离心是利用离心机产生的离心力，使样品中的颗粒沉降，从而实现液体和颗粒的分离。
上清液中包含了可溶性的蛋白质，而沉淀中则包含了细胞核、细胞壁等。
### **4. 层析（柱层析或凝胶层析）：**层析是蛋白质提取纯化中的关键步骤之一。
这一步旨在根据蛋白质的性质，通过将混合物在柱上或凝胶中进行分离。
常见的层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
层析可以根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性有选择性地分离目标蛋白质。
### **5. 电泳：**电泳是蛋白质分离和分析的重要手段。
在电场作用下，蛋白质根据其电荷和大小在凝胶中迁移。
蛋白质电泳分离可以用于检测样品的纯度、确定分子量等。
常见的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
### **6. 检测和分析：**在蛋白质提取纯化的过程中，需要对提取得到的蛋白质样品进行检测和分析。
生物化学中的蛋白质表达和纯化
生物化学中的蛋白质表达和纯化蛋白质是细胞中最基本的生物大分子之一，具有重要的结构和功能作用。
在生化实验研究中，常常需要大量的蛋白质作为实验材料。
蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中的关键技术之一。
本文将简要介绍蛋白质表达和纯化的原理和方法。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是将目的基因转录成RNA后再翻译成蛋白质的过程。
蛋白质表达主要有原核细胞和真核细胞两种方法。
原核细胞表达系统主要利用大肠杆菌，真核细胞表达系统则使用哺乳动物细胞，其主要的表达技术有以下几种：（一）重组蛋白质大规模表达重组蛋白质是指人为构建的同源或异源蛋白序列，利用基因工程技术将其导入到表达宿主中进行高效表达的蛋白质。
大肠杆菌是目前最常用的宿主。
一般来说，要将目的基因插入到选择性表达载体中，选用合适的启动子和终止子，将目的蛋白质与标签结合。
表达宿主随后被转化，蛋白质在生长过程中表达出来，随后进行纯化和鉴定。
（二）GST融合蛋白表达GST融合蛋白是利用GST (glutathione S-transferase)标签的蛋白质，将GST和目的蛋白质融合在一起表达，然后通过Glutathione 亲和层析纯化方法纯化目的蛋白质。
GST融合蛋白可以提高目的蛋白质的稳定性和可溶性，使得其在细胞内表达更加稳定。
（三）His标签蛋白表达His标签是一种聚组氨酸标签，可以与Ni2+螯合，因此可采用Ni2+亲和层析的方法纯化。
His标签融合蛋白表达时选择了较少的氨基酸标签，对目标蛋白的生物学性质和功能影响较小。
二、蛋白质纯化技术蛋白质表达和纯化是蛋白质生物化学研究的关键。
通常情况下，表达宿主细胞中的蛋白质必须经过纯化才能得到纯净的蛋白质，获得足够高纯度的蛋白质可用于测定其结构和功能。
（一）离子交换层析法离子交换层析法是利用蛋白质负荷（或正荷）的离子性质与相应的离子交换质团之间进行选择性结合的纯化方法。
离子交换层析法分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两种。
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蛋白质的表达、分离、纯化实验流程
蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
实验步骤
一：材料准备
1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠
2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒
二：实验操作
1.试剂准备：
2.
2. 获得目的基因
①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
3. 构建重组表达载体
①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
4. 获得含重组表达质粒的表达菌种
①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。
5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导
①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。
②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。
取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。
③对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG 至终浓度0.5 mmol/l，37 ℃继续培养1～3 h。
④12 000 rpm 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20 ℃或-70 ℃冰箱中。
6. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化
①NTA 层析柱的准备：在层析柱中加入1 mL NTA 介质，并分别用8 mL 去离子水，8 mL 上样缓冲液洗涤。
②重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5 mL 上样缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60 min，4℃12 000 rpm 离心30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。
取10 ul上清样品用于SDS-PAGE 分析。
③上清样品以10～15 mL/h 流速上Ni2+-NTA 柱，收集流出液，取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。
④洗脱杂蛋白：用Washing Buffer 以10～15 mL/h 流速洗柱，直至OD280 = 0.01 分步收集洗脱液，约3～4 h，取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。
⑤洗脱目标蛋白：用Elution Buffer 洗柱，收集每 1 mL 级分，分别取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。