实验动物学第三章 实验动物的微生物和寄生虫学控制
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2018/4/5 8
2018/4/5
感染小鼠病毒的种类
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• 采用普通级大小鼠作实验时, 实验处理可能诱发 隐性感染动物发生显性感染，并出现有关组织器 官的结构、生理生化与免疫学改变，可能会不同 程度影响实验结果 , 因而目前我国实验动物国家 标准中已经取消普通级大小鼠，这意味着科研教 学用的大小鼠必须使用清洁级或SPF级。 • 用普通级犬、猴等做研究时应加强检疫，做好饲 养管理工作，防止传染性疾病对实验的干扰。在 分析实验结果时，应考虑排除这些因素对实验的 影响。
2018/4/5 7
悉生动物（Gnotobiotic animal，简称GN） 定义：又称已知菌动物，指动物体内带有明确的 微生物种类的动物。 来源：人为将已知的微生物投给无菌动物，使其 体内带有已知菌。 • 单菌动物 • 双菌动物 • 多菌动物 悉生动物与无菌动物相比，生长发育正常，容 易饲养管理。 饲养条件：无菌隔离器内。
不同级别的动物必须饲养在相应的设施环境中，并有相应的饲养管理操作规程， 需要定期监测，保证其携带的微生物和寄生虫符合其等级标准。
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一、普通级动物（conventional (CV) animal） 定义：不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性 传染病病原的实验动物。简称普通动物。 来源：经微生物学检查不带有上述病原体的实验动 物。 饲养条件：普通开放环境。 应用：豚鼠、兔、犬、猴等大动物的实验研究。
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四、无菌级动物（germ free （GF）animal） 定义（指用现有的检测技术和方法在动物体内外 的任何部位均）无可检出的一切生命体的实 验动物。简称无菌动物。 来源：第一代通过无菌剖 腹产术，人工哺乳获得； 以后通过无菌动物雌雄交 配繁殖或无菌剖腹产术， 奶妈代奶扩群。 饲养条件：无菌隔离器内。
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5.抗辐射能力 GF 动物有较强的抗辐射能力。普通动物受辐射后 往往是由于细菌感染引起的并发症而造成动物死亡， GF动物就不存在这一问题，抗辐射的耐受量高。 6.生长发育 无菌状态下不同种属的生长发育有所不同。 GF 小鼠生长曲线在育成期与普通动物 (CV) 相似， 以后则逐渐减慢，最终GF动物的成年体重小于CV动 物。繁殖性能两者相似。 7.寿命 GF动物比CV动物要长得多。
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二、清洁级动物（clean（CL） animal） 定义：除普通级动物应排除的病原外，不携 带对动物危害大和对科学研究干扰大的病 原的实验动物。简称清洁动物。 来源：SPF动物扩群。 饲养条件：屏障系统大规模生产。 应用：各种科研、教学用大小鼠。
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三、无特定病原体级动物（specific pathogen free （SPF）animal) 定义：除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜 在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的 实验动物。简称无特定病原体动物或SPF动物。 来源：将无菌动物/悉生动物转移到屏障系统中 饲养繁殖。 饲养条件：屏障系统内大 规模生产/隔离器内保种。 应用：SPF大小鼠为国际 通行的科研用动物。
由于无菌动物几乎没有受过抗原刺激，其免疫机能基本上是处于原 始状态。胸腺、淋巴结发育不良；脾脏小，无二级滤泡。 4.泌尿系统 肾脏较小。
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（二）生理功能改变 1.免疫系统 ⑴免疫球蛋白及其合成率明显降低，血清中IgM、IgG水平低，无IgA。当 用低分子无抗原饲料喂无菌动物时，其血清中几乎不存在丙种球蛋白 和特异性抗体。 ⑵应答速度慢，过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象 消失或减弱。 ⑶对微生物感染异常敏感。 2.消化系统 肠上皮细胞更新率低，肠蠕动慢。 3.代谢 肠道中胆汁酸含量高。初级结合的胆汁酸在低部肠道更容易吸收，随 粪便的排出量大大减少。 4.生殖 无菌状态对生殖影响不大。
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设置哨兵动物的做法
• 每周在更换脏垫料笼盒时，每个笼盒取一小撮 脏垫料放到清洁的大小鼠笼盒内。
• 用收集的脏垫料加入适量清洁垫料作为哨兵动 物的垫料。
• 6周以后，处死动物进行微生物学和寄生虫学检 查。 • 如果某个动物得了某种传染病，污染的脏垫料 会传染给哨兵动物，我们通过检查哨兵动物就 知道该饲养室内是否有传染病发生。
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三、无菌动物和悉生动物的应用
（一）在微生物学研究中的应用 1.病原体的致病作用 2.正常菌群相互间的依存性和拮抗性关系 3.生态预防和生态治疗 （二）在免疫学研究中的应用 （三）在放射医学研究中的应用 （四）在营养代谢研究中的应用 （五）在老年病学研究中的应用 （六）在毒理学研究中的应用 （七）在肿瘤研究中的应用
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• 用抗生素能否造成无菌动物？
无菌动物 抗生素致无菌
方法 无菌状态
维持条件 生物学特 性
经无菌剖宫产术获得 注射大剂量抗生素获得 出生后生活在无菌状 注射后出现一过性无菌 态下 状态，不能做到绝对无 菌 无菌隔离器内 因先天未受到微生物 注射前体内外存在微生 刺激，消化系统、循 物，各系统解剖与生理 环系统和免疫系统具 功能与一般动物相同 有独特的特点
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约100%
可能 很高
约90%
可能 高
约40%
不可能 有疑问
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是不是用无菌动物/悉生动物做试验就一定好？
• 无菌动物（悉生动物）因其制作和维持成本昂 贵，虽然没有病原微生物的感染，但也没有存 在于体表体内的正常菌群，因而是非生态的， 一般仅限用于一些特定的研究。 • 采用SPF级和清洁级动物, 则可基本排除病原 微生物感染对实验的干扰，适用于绝大多数动 物实验研究。 • 豚鼠/兔一般只用普通级，但药物安全性评价 中过敏原性试验规定要用清洁级豚鼠。 • 犬、猴只有普通级。
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最初报道的无菌动物
动物
小鼠 大鼠 豚鼠 兔
培育者及育成时间
Pleasants, 1958 Reyniers等，1946 Pleasants, 1959 Miyakawa等，1958 Gustafsson, 1948 Tanami,1959
Wostmann和Pleasants,1959
猫
犬
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Bleby, 1969
Glims, 1946
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无菌隔离器的发明和无菌动物的培育成 功形成一门新兴学科--悉生生物学，它 是以无菌隔离技术提供的各种动物为实 验对象，研究实验动物本身以及动物与 微生物之间相互依存和制约关系。 悉生动物技术应用到实验动物上，成为 用来预防和消除实验动物自身疾病，提 供高质量实验动物的手段。
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微生物检测的方法
• 细菌学检测 取样---细菌分离---可疑菌落生化鉴定---血 清学反应 • 病毒学检测 1）血清学检测病毒抗体 2）分离病毒 • 寄生虫检测
体外寄生虫：透明胶纸黏取法、拔毛镜检法等 体内寄生虫：分泌物涂片法、组织剖面压印法等。
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思考题
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第二节
无菌级动物和悉生动物
一、无菌级动物和悉生动物的由来和发展 悉生动物：广义的悉生动物包括无菌动物和已知菌动物。 • 最初是研究微生物和动物（人）之间的依存关系而建立发 展起来的。 发展史： 1. 1895年-1910年：解决了动物可在无菌状态下生存的问题。 2. 1910年-1940年：因技术问题没有解决，悉生生物研究进 展缓慢。 3. 1940年- ：技术问题解决，悉生动物研究进展迅速。
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二、无菌动物的生物学特性
（一）形态学改变 1.消化系统 ⑴盲肠肥大，故GF动物的粪便比CV动物要稀，排尿量则少。 ⑵肠壁变薄，绒毛短，肠蠕动缓慢，食物通过肠道时间延长。 ⑶肝脏重量下降。 2.血液循环系统 心脏相对变小、白血球少、且数量波动范围小，这一特点与无 病原体入侵有关。 3.免疫系统
在动物实验过程中进行微生物检测一般采用设置“哨兵动 物”的方法。
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二、实验动物微生物学和寄生虫学检测国家标准 (教材p43-48)
普通级 病毒 细菌 寄生虫 小鼠 大鼠 地鼠 豚鼠 兔 犬 猴 4 1 6 6 5 4 4 2 2 2 2 2 病毒 5 2 1 1 1 清洁级 细菌 10 10 9 9 7 寄生虫 5 5 4 4 6 病毒 11 7 3 3 3 4 5 SPF级 细菌 16 16 15 15 13 7 6 寄生虫 7 7 5 6 7 5 6
1.根据对实验动物微生物学和寄生虫学的控制，可 将实验动物分为哪几类？各类动物的定义是什么？ 应饲养在什么环境中？ 2.一般动物实验是否用无菌动物/悉生动物做实验， 其结果一定比用SPF动物要好？ 3.试述无菌动物的生物学特性。 4.举例说明无菌动物在生物医学研究中的应用。 5.什么叫哨兵动物？
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三、取样原则、样本数、检查频率和检查方法 实验动物生产：随机采样 动物实验质量控制：设立哨兵动物 所谓的“哨兵动物”是指为微生物检测所设置的 指示动物。哨兵动物一般采用免疫功能正常的 清洁级或SPF级封闭群动物。 用途：监测动物实验饲养室内某些病原微生物的 感染情况；监测免疫缺陷动物的生产和动物实 验中某些病原微生物的感染情况。 检查频率：2-3个月一次。
第三章
实验动物的微生物学 和寄生虫学控制
第一节 实验动物按微生物学和寄生虫学 控制的分类 第二节 无菌级动物和悉生动物 第三节 实验动物的微生物学和寄生虫学 质量监测
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第一节 实验动物的微生物学 和寄生虫学分类法
按对微生物学和寄生虫学质量的控制，可将 实验动物分为四个级别： • 普通级动物(Conventional animal, CV) • 清洁级动物(Clean animal, CL) • 无特定病原体级动物(Specific pathogen free animal, SPF) • 无菌级动物(Germ free animal, GF)
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不同微生物级别动物用于实验的比较
项目 传染病 寄生虫 实验结果 应用动物数 GF/GN动物 无 无 准确 少 SPF动物 无 无 准确 少 CV动物 有或可能有 有或可能有 有疑问 多
统计学价值
长期实验 实验中死亡率
好
可能好 很低
可能好
可能好 低
不准确
困难 高
长期实验存活率
实验的正确设计 实验结果的统计价值
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四、无菌动物的生产与维持
（一）无菌动物的获得 1.预产期判断 2.剖宫产术 3.人工哺乳/奶妈代乳 （二）无菌动物质量检测 1.无菌隔离器内环境检测 2.无菌隔离器内动物检测
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第三节
实验动物的微生物学和寄 生虫学质量监测
一、进行微生物学监测的意义
所谓微生物监测是指用微生物学的方法对不同 等级的实验动物进行定期的抽样检查，以确认该 等级动物是否感染了某些病原体。因此，微生物 学监测是一个群体的、流行病学上的概念，它是 通过从一个群体中定期抽取少量样本进行检测， 从而判断整个群体中某一疾病流行情况的一种方 法。
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感染小鼠病毒的种类
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• 采用普通级大小鼠作实验时, 实验处理可能诱发 隐性感染动物发生显性感染，并出现有关组织器 官的结构、生理生化与免疫学改变，可能会不同 程度影响实验结果 , 因而目前我国实验动物国家 标准中已经取消普通级大小鼠，这意味着科研教 学用的大小鼠必须使用清洁级或SPF级。 • 用普通级犬、猴等做研究时应加强检疫，做好饲 养管理工作，防止传染性疾病对实验的干扰。在 分析实验结果时，应考虑排除这些因素对实验的 影响。
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悉生动物（Gnotobiotic animal，简称GN） 定义：又称已知菌动物，指动物体内带有明确的 微生物种类的动物。 来源：人为将已知的微生物投给无菌动物，使其 体内带有已知菌。 • 单菌动物 • 双菌动物 • 多菌动物 悉生动物与无菌动物相比，生长发育正常，容 易饲养管理。 饲养条件：无菌隔离器内。
不同级别的动物必须饲养在相应的设施环境中，并有相应的饲养管理操作规程， 需要定期监测，保证其携带的微生物和寄生虫符合其等级标准。
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一、普通级动物（conventional (CV) animal） 定义：不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性 传染病病原的实验动物。简称普通动物。 来源：经微生物学检查不带有上述病原体的实验动 物。 饲养条件：普通开放环境。 应用：豚鼠、兔、犬、猴等大动物的实验研究。
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四、无菌级动物（germ free （GF）animal） 定义（指用现有的检测技术和方法在动物体内外 的任何部位均）无可检出的一切生命体的实 验动物。简称无菌动物。 来源：第一代通过无菌剖 腹产术，人工哺乳获得； 以后通过无菌动物雌雄交 配繁殖或无菌剖腹产术， 奶妈代奶扩群。 饲养条件：无菌隔离器内。
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5.抗辐射能力 GF 动物有较强的抗辐射能力。普通动物受辐射后 往往是由于细菌感染引起的并发症而造成动物死亡， GF动物就不存在这一问题，抗辐射的耐受量高。 6.生长发育 无菌状态下不同种属的生长发育有所不同。 GF 小鼠生长曲线在育成期与普通动物 (CV) 相似， 以后则逐渐减慢，最终GF动物的成年体重小于CV动 物。繁殖性能两者相似。 7.寿命 GF动物比CV动物要长得多。
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二、清洁级动物（clean（CL） animal） 定义：除普通级动物应排除的病原外，不携 带对动物危害大和对科学研究干扰大的病 原的实验动物。简称清洁动物。 来源：SPF动物扩群。 饲养条件：屏障系统大规模生产。 应用：各种科研、教学用大小鼠。
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三、无特定病原体级动物（specific pathogen free （SPF）animal) 定义：除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜 在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的 实验动物。简称无特定病原体动物或SPF动物。 来源：将无菌动物/悉生动物转移到屏障系统中 饲养繁殖。 饲养条件：屏障系统内大 规模生产/隔离器内保种。 应用：SPF大小鼠为国际 通行的科研用动物。
由于无菌动物几乎没有受过抗原刺激，其免疫机能基本上是处于原 始状态。胸腺、淋巴结发育不良；脾脏小，无二级滤泡。 4.泌尿系统 肾脏较小。
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（二）生理功能改变 1.免疫系统 ⑴免疫球蛋白及其合成率明显降低，血清中IgM、IgG水平低，无IgA。当 用低分子无抗原饲料喂无菌动物时，其血清中几乎不存在丙种球蛋白 和特异性抗体。 ⑵应答速度慢，过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象 消失或减弱。 ⑶对微生物感染异常敏感。 2.消化系统 肠上皮细胞更新率低，肠蠕动慢。 3.代谢 肠道中胆汁酸含量高。初级结合的胆汁酸在低部肠道更容易吸收，随 粪便的排出量大大减少。 4.生殖 无菌状态对生殖影响不大。
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设置哨兵动物的做法
• 每周在更换脏垫料笼盒时，每个笼盒取一小撮 脏垫料放到清洁的大小鼠笼盒内。
• 用收集的脏垫料加入适量清洁垫料作为哨兵动 物的垫料。
• 6周以后，处死动物进行微生物学和寄生虫学检 查。 • 如果某个动物得了某种传染病，污染的脏垫料 会传染给哨兵动物，我们通过检查哨兵动物就 知道该饲养室内是否有传染病发生。
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三、无菌动物和悉生动物的应用
（一）在微生物学研究中的应用 1.病原体的致病作用 2.正常菌群相互间的依存性和拮抗性关系 3.生态预防和生态治疗 （二）在免疫学研究中的应用 （三）在放射医学研究中的应用 （四）在营养代谢研究中的应用 （五）在老年病学研究中的应用 （六）在毒理学研究中的应用 （七）在肿瘤研究中的应用
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• 用抗生素能否造成无菌动物？
无菌动物 抗生素致无菌
方法 无菌状态
维持条件 生物学特 性
经无菌剖宫产术获得 注射大剂量抗生素获得 出生后生活在无菌状 注射后出现一过性无菌 态下 状态，不能做到绝对无 菌 无菌隔离器内 因先天未受到微生物 注射前体内外存在微生 刺激，消化系统、循 物，各系统解剖与生理 环系统和免疫系统具 功能与一般动物相同 有独特的特点
2018/4/5
约100%
可能 很高
约90%
可能 高
约40%
不可能 有疑问
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是不是用无菌动物/悉生动物做试验就一定好？
• 无菌动物（悉生动物）因其制作和维持成本昂 贵，虽然没有病原微生物的感染，但也没有存 在于体表体内的正常菌群，因而是非生态的， 一般仅限用于一些特定的研究。 • 采用SPF级和清洁级动物, 则可基本排除病原 微生物感染对实验的干扰，适用于绝大多数动 物实验研究。 • 豚鼠/兔一般只用普通级，但药物安全性评价 中过敏原性试验规定要用清洁级豚鼠。 • 犬、猴只有普通级。
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最初报道的无菌动物
动物
小鼠 大鼠 豚鼠 兔
培育者及育成时间
Pleasants, 1958 Reyniers等，1946 Pleasants, 1959 Miyakawa等，1958 Gustafsson, 1948 Tanami,1959
Wostmann和Pleasants,1959
猫
犬
2018/4/5
Bleby, 1969
Glims, 1946
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无菌隔离器的发明和无菌动物的培育成 功形成一门新兴学科--悉生生物学，它 是以无菌隔离技术提供的各种动物为实 验对象，研究实验动物本身以及动物与 微生物之间相互依存和制约关系。 悉生动物技术应用到实验动物上，成为 用来预防和消除实验动物自身疾病，提 供高质量实验动物的手段。
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微生物检测的方法
• 细菌学检测 取样---细菌分离---可疑菌落生化鉴定---血 清学反应 • 病毒学检测 1）血清学检测病毒抗体 2）分离病毒 • 寄生虫检测
体外寄生虫：透明胶纸黏取法、拔毛镜检法等 体内寄生虫：分泌物涂片法、组织剖面压印法等。
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思考题
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第二节
无菌级动物和悉生动物
一、无菌级动物和悉生动物的由来和发展 悉生动物：广义的悉生动物包括无菌动物和已知菌动物。 • 最初是研究微生物和动物（人）之间的依存关系而建立发 展起来的。 发展史： 1. 1895年-1910年：解决了动物可在无菌状态下生存的问题。 2. 1910年-1940年：因技术问题没有解决，悉生生物研究进 展缓慢。 3. 1940年- ：技术问题解决，悉生动物研究进展迅速。
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二、无菌动物的生物学特性
（一）形态学改变 1.消化系统 ⑴盲肠肥大，故GF动物的粪便比CV动物要稀，排尿量则少。 ⑵肠壁变薄，绒毛短，肠蠕动缓慢，食物通过肠道时间延长。 ⑶肝脏重量下降。 2.血液循环系统 心脏相对变小、白血球少、且数量波动范围小，这一特点与无 病原体入侵有关。 3.免疫系统
在动物实验过程中进行微生物检测一般采用设置“哨兵动 物”的方法。
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二、实验动物微生物学和寄生虫学检测国家标准 (教材p43-48)
普通级 病毒 细菌 寄生虫 小鼠 大鼠 地鼠 豚鼠 兔 犬 猴 4 1 6 6 5 4 4 2 2 2 2 2 病毒 5 2 1 1 1 清洁级 细菌 10 10 9 9 7 寄生虫 5 5 4 4 6 病毒 11 7 3 3 3 4 5 SPF级 细菌 16 16 15 15 13 7 6 寄生虫 7 7 5 6 7 5 6
1.根据对实验动物微生物学和寄生虫学的控制，可 将实验动物分为哪几类？各类动物的定义是什么？ 应饲养在什么环境中？ 2.一般动物实验是否用无菌动物/悉生动物做实验， 其结果一定比用SPF动物要好？ 3.试述无菌动物的生物学特性。 4.举例说明无菌动物在生物医学研究中的应用。 5.什么叫哨兵动物？
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三、取样原则、样本数、检查频率和检查方法 实验动物生产：随机采样 动物实验质量控制：设立哨兵动物 所谓的“哨兵动物”是指为微生物检测所设置的 指示动物。哨兵动物一般采用免疫功能正常的 清洁级或SPF级封闭群动物。 用途：监测动物实验饲养室内某些病原微生物的 感染情况；监测免疫缺陷动物的生产和动物实 验中某些病原微生物的感染情况。 检查频率：2-3个月一次。
第三章
实验动物的微生物学 和寄生虫学控制
第一节 实验动物按微生物学和寄生虫学 控制的分类 第二节 无菌级动物和悉生动物 第三节 实验动物的微生物学和寄生虫学 质量监测
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第一节 实验动物的微生物学 和寄生虫学分类法
按对微生物学和寄生虫学质量的控制，可将 实验动物分为四个级别： • 普通级动物(Conventional animal, CV) • 清洁级动物(Clean animal, CL) • 无特定病原体级动物(Specific pathogen free animal, SPF) • 无菌级动物(Germ free animal, GF)
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不同微生物级别动物用于实验的比较
项目 传染病 寄生虫 实验结果 应用动物数 GF/GN动物 无 无 准确 少 SPF动物 无 无 准确 少 CV动物 有或可能有 有或可能有 有疑问 多
统计学价值
长期实验 实验中死亡率
好
可能好 很低
可能好
可能好 低
不准确
困难 高
长期实验存活率
实验的正确设计 实验结果的统计价值
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四、无菌动物的生产与维持
（一）无菌动物的获得 1.预产期判断 2.剖宫产术 3.人工哺乳/奶妈代乳 （二）无菌动物质量检测 1.无菌隔离器内环境检测 2.无菌隔离器内动物检测
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第三节
实验动物的微生物学和寄 生虫学质量监测
一、进行微生物学监测的意义
所谓微生物监测是指用微生物学的方法对不同 等级的实验动物进行定期的抽样检查，以确认该 等级动物是否感染了某些病原体。因此，微生物 学监测是一个群体的、流行病学上的概念，它是 通过从一个群体中定期抽取少量样本进行检测， 从而判断整个群体中某一疾病流行情况的一种方 法。