核酸分子杂交技术
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3、影响复性的因素 1） DNA浓度 DNA浓度越大复性速度越快 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1-0.5μ g，浓度过高影响杂交效率 2）DNA的分子质量 大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢
10
核酸分子杂交的基本理论
3）温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性
4）离子强度 通常盐浓度较高时，复性速度较快。 5）甲酰胺 甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待 测核酸杂交更稳定 当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42 ℃杂交； 如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交
12
核酸分子杂交的基本理论
6）核酸分子的复杂性 同样条件下， DNA 序列简单的分子复性快，序列较复杂的 DNA 分子 复性则较慢。 7）非特异性杂交反应： 杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 常用的封闭物有两类：即非特异性 DNA 和高分子化合物。如鲑精 DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉
3 ） RNA探针：可以是标记分离的 RNA，也可以是重组质粒在 RNA 聚
合酶作用下的转录产物。复杂性低，杂交效率高，但易降解，标记方法 复杂。
4）人工合成的寡核苷酸探针： 检测点突变和小段碱基的缺失或插入
16
核酸探针及其标记
核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合 部位获得可识别的信号。理想标记物应具备的特性： 高度灵敏性
狭线印迹杂交（slot blotting）
原位杂交
28
核酸分子杂交方法
Southern 印迹杂交
使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移
并结合在适当的滤膜上，然后通过同 标记的单链DNA或 RNA探针的杂交 作用检测这些被转移的DNA片段， 这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。 1975年，苏格兰爱丁堡大学
更适于核酸样品的定量检测 原理与Southern杂交相同
将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上
在实验过程中，使用特殊设计的加样装置，使众多的待检测样品能够一 次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵
6
核酸分子杂交的基本理论
3、影响变性的因素 1）碱基组成 ：DNA分子中G＋C含量越高Tm越高。 2）溶液的离子强度 ：DNA链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们
之间的静电相斥作用是其双链的不稳定因素之一。在无盐的水中，DNA在
室温下就会变性，加入盐后，正离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA 稳定性增加，Tm值升高。 3）pH值 ：pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。在高pH值下，可使 碱基失去形成氢键的能力。当pH大于11.3时所有氢键均被破坏，DNA完 全变性。 4）变性剂：可以干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常 用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50％的甲酰胺以使Tm值降低30 ℃。
30
（ a）
基因组DNA
DNA限制片段
（b） Southern blot 操作流程 （ c）
（d）
硝酸纤维素滤膜
（ e）
同探针同源杂交的基因 DNA片段 X光底片
31
核酸分子杂交方法
Southern杂交 的主要应用 1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析
3.PCR产物分析
32
核酸分子杂交方法
Northern印迹杂交
7
核酸分子杂交的基本理论
4、核酸溶液变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪 变性过程）
8
核酸分子杂交的基本理论
DNA复性
1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核 酸的过程，称复性或杂交。
25
核酸探针的标记方法
PCR标记法
将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经
PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中 非放射性物质标记 目前用得最多的是生物素和地高辛精
26
目 录
part4
27
核酸分子杂交方法
Southern 印迹杂交（Southern blot） Northern 印记杂交（Nouthern blot ） 斑点印迹杂交（dot blotting）
33
核酸分子杂交方法
Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性 状态，避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解（变性凝胶电泳(甲 醛、尿素、甲酰胺等) RNase抑制环境 ），DNA电泳前和电泳中不变 性
2 、转膜： RNA 转膜前不需变性和中和处理， Southern 印迹时，
DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA
Hybridization of Nucleic Acids
DNA1 DNA2 DNA
RNA
探针
Northern hybridization
Southern hybridization
核酸分子杂交方法
斑点印迹杂交（dot blotting） 狭线印迹杂交（slot blotting）
核酸分子杂交技术 高俊燕
博 奥 生 物 集 团 有 限 公 司 生物芯片北京国家工程研究中心 北京博奥晶典生物技术有限公司
目录 核酸分子杂交的基本理论 核酸探针及其标记 核酸探针的标记方法 核酸分子杂交方法
DNA芯片技术
2
目 录
part 1
3
核酸分子杂交的基本理论
核酸分子杂交
具有互补序列的两条单链核酸 (DNA或RNA)分子在适宜的温度及离 子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则退火形成双链杂合体的过程称 为核酸分子杂交。 核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的 技术之一，也是临床分子检验的重要技术。 核酸分子杂交技术是 20 世纪 70 年代发展起来的一种崭新的分子生物 学技术。它是基于 DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针 与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形 式的不同可以分为液相杂交和固相杂交，各类型杂交的基本原理和步骤 是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。
次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的
核苷酸掺入到新的DNA链中
20
21
22
核酸探针的标记方法
随机引物法
其原理是随机引物能与各种单链 DNA 模板结合，作为合成新链的引物，在 DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模 板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的 DNA链。 合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中。 随机引物法所具有的优点： 1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题 3、标记活性高 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记
DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20-25℃ RNA/DNA 或 RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值 （原位杂交时， 杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态 结构的破坏以及标本的脱落） 用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
11
核酸分子杂交的基本理论
不影响碱基配对的特异性
不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大
检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
核酸分子杂交技术的广泛应用，在很大程度上取决于高敏感性检测的各种标记 物。根据标记物本身的性质及检测特点，可分为放射性核素及非放射性物质的
标记物。
17
核酸探针及其标记
18
目 录
part 3
19
核酸探针的标记方法
切口平移法（nick translation labeling)
是目前实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法 。利用大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探 针被标记。 带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。 1）利用DNase I在DNA双链上造成单链切口 2）利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从 5末端逐步切除 3 ）在 DNA 聚合酶 I 的53 聚合酶催化下，以互补的 DNA单链为模板依
13
目 录
Part 2
14
核酸探针及其标记
探针的概念
核酸探针 (probe)是指用放射性核素或其它标记物标记的已知序列的核 酸片段。 长度一般以50~300bp为宜。制备方法： (1) DNA重组技术
(2) PCR扩增
(3) 化学合成
15
核酸探针及其标记
核酸探针的种类
1 ）基因组 DNA 探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞 DNA探针，多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 2 ） cDNA 探针 ： 以 mRNA 为 模 板 经 过 逆转 录 酶 催 化 产生 的 互 补 于 mRNA的DNA链。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：
DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA 和 寡核苷酸/RNA。 2、复性过程
1）单链分子间碰撞形成局部双链
2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列
3）形成完整的双链分子
9
核酸分子杂交的基本理论
1、放射性标记物 放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。 常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。 优点：灵敏度高，可检测到10-18~10-4g的物质； 很高的特异性，假阳性结果较少。 缺点：辐射危害（易造成放射性污染） 同位素的半衰期限制 2、非放射性标记物 生物素、地高辛精、荧光化合物
1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到 硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方 法 因 这 种 方 法 与 Southern blot 杂 交 技 术 十 分 类 似 ， 与 DNA 的 杂 交 （Southern 杂交）相对应，被称为Northern杂交。 基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 鉴别RNA 探针可用DNA或RNA片段 待测样品为总RNA或mRNA
4
核酸分子杂交的基本理论
关键步骤：
变性—杂交（复性）—检测信号—结论
变性
ห้องสมุดไป่ตู้复性
DNA-DNA 杂交双链分子
信号的采集与处理
结论
5
核酸分子杂交的基本理论
DNA变性
1、定义：在某些理化因素作用下，两条DNA链间的氢键断裂，变为单 链的过程称DNA变性。 2、变性的方法： 1 ）热变性：温度升高到 90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全 断裂。 2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。 3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢 键断裂
Edwin Mellor Southern
E.M. Southern首先设计出来的，故又称Southern blot。
29
核酸分子杂交方法
Southern杂交的主要步骤： 1）待测核酸样品的制备 2）待测DNA样品的电泳分离 3）凝胶中DNA的变性：碱变性（NaOH溶液） 4）Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5）Southern杂交 6）杂交结果的检测
23
24
核酸探针的标记方法
末端标记法(terminal labeling)
1）3’末端标记 在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的[α -32P]dNTP。 3’末 端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3’标记有两种方式： 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法和T4DNA聚合酶标记 法 2） 5’末端标记 先用碱性磷酸酶（AP ）去掉dsDNA 5`-磷酸，在T4多核苷酸激酶的 催化下，使 ATP分子上的γ 磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5’－ OH基团上。因此采用γ -32P-ATP为底物，即可将DNA样品5’端标记。 但核酸样品5’端必需是去磷酸的。
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核酸分子杂交的基本理论
3）温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性
4）离子强度 通常盐浓度较高时，复性速度较快。 5）甲酰胺 甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待 测核酸杂交更稳定 当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42 ℃杂交； 如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交
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核酸分子杂交的基本理论
6）核酸分子的复杂性 同样条件下， DNA 序列简单的分子复性快，序列较复杂的 DNA 分子 复性则较慢。 7）非特异性杂交反应： 杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 常用的封闭物有两类：即非特异性 DNA 和高分子化合物。如鲑精 DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉
3 ） RNA探针：可以是标记分离的 RNA，也可以是重组质粒在 RNA 聚
合酶作用下的转录产物。复杂性低，杂交效率高，但易降解，标记方法 复杂。
4）人工合成的寡核苷酸探针： 检测点突变和小段碱基的缺失或插入
16
核酸探针及其标记
核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合 部位获得可识别的信号。理想标记物应具备的特性： 高度灵敏性
狭线印迹杂交（slot blotting）
原位杂交
28
核酸分子杂交方法
Southern 印迹杂交
使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移
并结合在适当的滤膜上，然后通过同 标记的单链DNA或 RNA探针的杂交 作用检测这些被转移的DNA片段， 这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。 1975年，苏格兰爱丁堡大学
更适于核酸样品的定量检测 原理与Southern杂交相同
将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上
在实验过程中，使用特殊设计的加样装置，使众多的待检测样品能够一 次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵
6
核酸分子杂交的基本理论
3、影响变性的因素 1）碱基组成 ：DNA分子中G＋C含量越高Tm越高。 2）溶液的离子强度 ：DNA链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们
之间的静电相斥作用是其双链的不稳定因素之一。在无盐的水中，DNA在
室温下就会变性，加入盐后，正离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA 稳定性增加，Tm值升高。 3）pH值 ：pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。在高pH值下，可使 碱基失去形成氢键的能力。当pH大于11.3时所有氢键均被破坏，DNA完 全变性。 4）变性剂：可以干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常 用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50％的甲酰胺以使Tm值降低30 ℃。
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（ a）
基因组DNA
DNA限制片段
（b） Southern blot 操作流程 （ c）
（d）
硝酸纤维素滤膜
（ e）
同探针同源杂交的基因 DNA片段 X光底片
31
核酸分子杂交方法
Southern杂交 的主要应用 1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析
3.PCR产物分析
32
核酸分子杂交方法
Northern印迹杂交
7
核酸分子杂交的基本理论
4、核酸溶液变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪 变性过程）
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核酸分子杂交的基本理论
DNA复性
1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核 酸的过程，称复性或杂交。
25
核酸探针的标记方法
PCR标记法
将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经
PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中 非放射性物质标记 目前用得最多的是生物素和地高辛精
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目 录
part4
27
核酸分子杂交方法
Southern 印迹杂交（Southern blot） Northern 印记杂交（Nouthern blot ） 斑点印迹杂交（dot blotting）
33
核酸分子杂交方法
Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性 状态，避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解（变性凝胶电泳(甲 醛、尿素、甲酰胺等) RNase抑制环境 ），DNA电泳前和电泳中不变 性
2 、转膜： RNA 转膜前不需变性和中和处理， Southern 印迹时，
DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA
Hybridization of Nucleic Acids
DNA1 DNA2 DNA
RNA
探针
Northern hybridization
Southern hybridization
核酸分子杂交方法
斑点印迹杂交（dot blotting） 狭线印迹杂交（slot blotting）
核酸分子杂交技术 高俊燕
博 奥 生 物 集 团 有 限 公 司 生物芯片北京国家工程研究中心 北京博奥晶典生物技术有限公司
目录 核酸分子杂交的基本理论 核酸探针及其标记 核酸探针的标记方法 核酸分子杂交方法
DNA芯片技术
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目 录
part 1
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核酸分子杂交的基本理论
核酸分子杂交
具有互补序列的两条单链核酸 (DNA或RNA)分子在适宜的温度及离 子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则退火形成双链杂合体的过程称 为核酸分子杂交。 核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的 技术之一，也是临床分子检验的重要技术。 核酸分子杂交技术是 20 世纪 70 年代发展起来的一种崭新的分子生物 学技术。它是基于 DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针 与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形 式的不同可以分为液相杂交和固相杂交，各类型杂交的基本原理和步骤 是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。
次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的
核苷酸掺入到新的DNA链中
20
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22
核酸探针的标记方法
随机引物法
其原理是随机引物能与各种单链 DNA 模板结合，作为合成新链的引物，在 DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模 板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的 DNA链。 合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中。 随机引物法所具有的优点： 1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题 3、标记活性高 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记
DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20-25℃ RNA/DNA 或 RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值 （原位杂交时， 杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态 结构的破坏以及标本的脱落） 用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
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核酸分子杂交的基本理论
不影响碱基配对的特异性
不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大
检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
核酸分子杂交技术的广泛应用，在很大程度上取决于高敏感性检测的各种标记 物。根据标记物本身的性质及检测特点，可分为放射性核素及非放射性物质的
标记物。
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核酸探针及其标记
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目 录
part 3
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核酸探针的标记方法
切口平移法（nick translation labeling)
是目前实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法 。利用大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探 针被标记。 带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。 1）利用DNase I在DNA双链上造成单链切口 2）利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从 5末端逐步切除 3 ）在 DNA 聚合酶 I 的53 聚合酶催化下，以互补的 DNA单链为模板依
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目 录
Part 2
14
核酸探针及其标记
探针的概念
核酸探针 (probe)是指用放射性核素或其它标记物标记的已知序列的核 酸片段。 长度一般以50~300bp为宜。制备方法： (1) DNA重组技术
(2) PCR扩增
(3) 化学合成
15
核酸探针及其标记
核酸探针的种类
1 ）基因组 DNA 探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞 DNA探针，多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 2 ） cDNA 探针 ： 以 mRNA 为 模 板 经 过 逆转 录 酶 催 化 产生 的 互 补 于 mRNA的DNA链。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：
DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA 和 寡核苷酸/RNA。 2、复性过程
1）单链分子间碰撞形成局部双链
2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列
3）形成完整的双链分子
9
核酸分子杂交的基本理论
1、放射性标记物 放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。 常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。 优点：灵敏度高，可检测到10-18~10-4g的物质； 很高的特异性，假阳性结果较少。 缺点：辐射危害（易造成放射性污染） 同位素的半衰期限制 2、非放射性标记物 生物素、地高辛精、荧光化合物
1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到 硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方 法 因 这 种 方 法 与 Southern blot 杂 交 技 术 十 分 类 似 ， 与 DNA 的 杂 交 （Southern 杂交）相对应，被称为Northern杂交。 基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 鉴别RNA 探针可用DNA或RNA片段 待测样品为总RNA或mRNA
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核酸分子杂交的基本理论
关键步骤：
变性—杂交（复性）—检测信号—结论
变性
ห้องสมุดไป่ตู้复性
DNA-DNA 杂交双链分子
信号的采集与处理
结论
5
核酸分子杂交的基本理论
DNA变性
1、定义：在某些理化因素作用下，两条DNA链间的氢键断裂，变为单 链的过程称DNA变性。 2、变性的方法： 1 ）热变性：温度升高到 90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全 断裂。 2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。 3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢 键断裂
Edwin Mellor Southern
E.M. Southern首先设计出来的，故又称Southern blot。
29
核酸分子杂交方法
Southern杂交的主要步骤： 1）待测核酸样品的制备 2）待测DNA样品的电泳分离 3）凝胶中DNA的变性：碱变性（NaOH溶液） 4）Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5）Southern杂交 6）杂交结果的检测
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核酸探针的标记方法
末端标记法(terminal labeling)
1）3’末端标记 在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的[α -32P]dNTP。 3’末 端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3’标记有两种方式： 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法和T4DNA聚合酶标记 法 2） 5’末端标记 先用碱性磷酸酶（AP ）去掉dsDNA 5`-磷酸，在T4多核苷酸激酶的 催化下，使 ATP分子上的γ 磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5’－ OH基团上。因此采用γ -32P-ATP为底物，即可将DNA样品5’端标记。 但核酸样品5’端必需是去磷酸的。