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基于对海栖热孢菌来源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的结构分析揭

示其热稳定性和底物特异性特征

从海栖热孢菌MSB8中提取的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(TmAFase)是一种高耐热性半纤维素外切酶,与其他51糖苷水解酶家族的酶相比较，作用于阿拉伯糖和木聚糖时显示出了相对较高的活性。在目前的研究中，我们完成了关于阿拉伯糖苷酶的酶动力学特性和结构分析的工作。在海栖热孢菌就来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）中发现的紧密领域协同作用,比如在每一个单体上的一个域间二硫键(Cys306和Cys476),在二聚物的界面上的一个新的延伸臂(氨基酸374-385),和六聚体上的所有12个盐桥,应该是酶的热稳定性的原因。木聚糖聚合力的决定因素之一(Trp96)被确认是在活性部位,一定范围的氨基酸(374 - 385)突出隆起在底物结合位点生成一个凹点并形成一个明显的墙层来。蚀变性的小洞形状，带有一个强大的负静电分布，可能与海栖热孢菌就来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）的支化聚合物基质与独特的结构衬底有关。

关键词：海栖热孢菌阿拉伯糖苷酶结构分析X-衍射结晶学

半纤维素是由各种戊糖糖、己糖糖,糖和酸组成的最丰富、可再生多相聚合物之一。最近,研究人员正高度关注在半纤维素等各种可发酵糖的高效分解，生物燃料和化学品的生产方面。由于半纤维素生物质在结构上极高的复杂性和可变性,因而,几个半纤维素酶的协同作用主要包括裂解开链外切-β-(1,4)木聚糖酶和β-xylosidases和侧面消除开链辅助酶,对这些生物质材料的完全降解至关重要。α-L-阿拉伯

呋喃糖苷酶(AFase; E.C. 3.2.1.55)是最重要的辅助酶,这种酶可以催化水解的终端那些非还原性的α-L -(1、2),α-L -(1,3),和α-L -(1、5)-arabinofuranosyl 残留物来源于arabinose-containing多糖,如阿拉伯多糖和阿糖基木聚糖。当作用于高分子聚合物时，这些酶与半纤维素酶结合可以协同性加快糖苷键的水解作用。

阿拉伯呋喃糖苷酶(AFase)主要属于糖苷水解酶(GH)家族51和54[1,6]。在过去的几十年，AFases重要组成部分的结构功能关系已经在许多研究中得出了。自从Hövel et al.[8]从嗜热脂肪土芽孢杆菌T-6中确定阿拉伯呋喃糖苷酶（AFase）的三维结构，微生物来源的AFases 结构已经在梭状芽胞杆菌thermocellum ATCC 27405 [22]和热杆菌属木聚糖的研究中被报道过了。

在目前的研究中,我们使用固定大肠杆菌表达的重组海栖热孢菌就来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）并确定其三维结构。后来，这个结构被用于与其他GH-51家族酶相比较，以更好地了解其在功能方面的高耐热性和独特的底物特异性。

材料和方法

基因表达与酶纯化

酶活性测定

结晶和数据收集

结构测定与数据收集

结果与讨论

阿拉伯糖苷酶的酶特征

在此之前，我们从海栖热孢菌MSB8和杆菌属KCTC 3012中克隆了海栖热孢菌就来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）和阿拉伯木聚糖苷酶（GAFase）的基因，并且让它们分别在大肠杆菌中进行异源性表达。虽然阿拉伯糖苷酶与阿拉伯木聚糖苷酶在氨基酸序列上只有36%的一致性，但是它属于GH 51家族中典型的外部作用酶，在裂解阿拉伯多糖末端残基中的非还原性的多个分支，包括α-L-(1,2)-，α-L-(1,3)-和α-L-(1,5) 阿拉伯糖，然而，它们的最佳反应温度和底物专一性彼此间完全不同。实验中显示出，海栖热孢菌属的阿拉伯糖苷酶的最适温度显示在80℃以上（在pH在4.5的情况下），100℃时它的热稳定性半衰期为235分钟，然而阿拉伯木聚糖苷酶（GAFase）的最佳温度在60℃（在pH 6.0的情况下）。

基于图表1中所显示，高度耐热的海栖热孢菌就来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）在阿拉伯木聚糖苷酶（GAFase）中很容易被辨识区分出来。海栖热孢菌来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）作用于多种聚合物基底时与GAFase相比而言，有着相对更高的反应活性。在聚合物基底中，甜菜的分支中的阿拉伯糖是海栖热孢菌来源阿拉伯呋喃糖苷酶最适宜的底物，然而主干中的阿拉伯糖更适合木聚糖阿拉伯糖苷酶。事实上，相对于GAFase(0.16 U/mg)极其低的活性，海栖热孢菌就来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）(3.34 U/mg)对燕麦木聚糖（一种阿拉伯木聚糖）有相当好的水解作用。与GAFase相比，有着较高的最适温度的海栖热孢菌就来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）很可能在聚合物底物的酶解反应中提供相对更高的能

量。此外，海栖热孢菌就来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）适用于木聚糖的水解，对阿拉伯木聚糖也有更好的侧枝剪切力。阿拉伯木聚糖是半纤维素中的重要部分之一，在具有较高的酶活性的酶类中，热稳定好这一点能满足从半纤维素生物质中提取珍贵戊糖等成分的

需要。

结晶化与结构测定

结构良好的晶体（具有代表性的，并且有着明显清晰表面的矩形板形状）在四天后可以被检测到。具有典型性的尺寸大小，可以成长到0.2*0.5mm左右的晶体。光衍射模式下，可以看出一个单斜的晶体晶胞，晶体参数为a = 103.710, b = 161.538, c = 112.602 Å, β= 106.301。就目前如我们所知，在一个不对称的结晶性分子晶体单体结构中，通常有六个分子。海栖热孢菌就来源的阿拉伯呋喃糖苷酶（TmAFase）的晶体分子(PDB code; 4ATW)结构，在3.0 Å分辨率下，使用分子置换法（MR），以分子结构最接近的作为参照（36%的序列同源性）并进行计算和测评。实验要求通过麦休斯系数来计算达到2.73 Å3 Da-1，溶剂用量在CCP4i组合的读数表软件中得到54.97%的结果。根据中国国家标准CNS来进行初步操作的细化和分类，利用极大似然估计法在目标范围内进行分析。实验中的模型，进行了刚性体结构的细化和分析，还有模拟退火算法，在定位参数的周期循环中反复提炼迭代优化。在使用的Coot程序中，组建蛋白质模型的操作要求，每一个精良制作的圆形物在循环中总是后面紧跟着手工制作的装置备件。最终操作中，这个精制所得到的模型，将会会聚得到22.999%