微生物学--分枝杆菌属

离心取沉淀法集菌：尿液，留取全天尿量，静置 数小时后，弃去上清液，取沉淀部分尿液1015MI于试管内，3000转/分，离心30分，取沉 淀涂片，涂片要厚。
（2）染色：①涂片自然干燥后火焰固定；②滴加 苯酚复红染液初染，加热媒染；③滴加3%盐酸酒 精脱色；④滴加亚甲蓝复染液复染；⑤镜检。
（3）镜检：在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色， 其他细菌和细胞呈蓝色。镜检时应仔细查遍全片 或至少观察100个视野，涂片镜检应报告“找到 抗酸杆菌”或“未找到抗酸杆菌”，而不能报告 “找到结核分枝杆菌”。
阴性 注射部位有针眼大的红点或稍有红肿,硬结直径小 于0.5cm，说明无结核感染，但应考虑下述情况：如受 试者处于原发感染的早期，或正患有其它传染病（如寻 麻疹、霍奇金病 、结节病 、爱滋病。 ）
（4）缺陷 ①特异性低 ②敏感性较低 ③导致局部炎症和瘢痕
2.抗原检测 3.抗结核抗体（IgG）检测 4.T-SPOT.TB检测
四 微生物检验
〈一〉标本采集 根据感染部位的不同，采集不同的标本，标本采 集是否合格，也是决定检验结果是否可靠的最基 本的一步。
（1）呼吸道标本：即时痰、晨痰、夜间痰，注意
痰的性状是否合格。 （2）尿液：晨尿或无菌尿 （3）粪便 （4）其他标本
<二>标本直接镜检 抗酸染色步骤
（1）涂片：可采用直接涂片、漂浮集菌或离心取沉 淀集菌涂片。直接涂片痰液标本用折断的竹签茬 挑取干酪样或脓性痰部分，血痰应挑取血与痰的 交界处，取痰量0.05MI涂于已编号载玻片有2/3 处，在酒精灯火焰上方均匀涂抹成2*1CM大小痰 膜。脓液标本同痰涂片法，但要稍薄于痰涂片。
分枝杆菌属
一、分类
分枝杆菌属（Mycobacterium) 是分枝 杆菌科的唯一菌数，有时呈分枝狀生长 而得名。根据国际分支杆菌分类研究组 的方案将本菌分为三类，即结合分支杆 菌复合群、非结核分枝杆菌和不能培养 菌麻风分枝杆菌；根据生长速度分为快 生长群和慢生长群；根据分支杆菌光反 应性分为3群。
二、临床意义
指结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。 又称非典型分枝杆菌。 广泛分布于外环境和人及动物的机体中。作为条件致病 菌常引起有潜在肺部感染、免疫抑制和开放性外伤患者的 感染。不通过人与人进行传播。
警钟长鸣——NTM潜在杀手？
卫生部关于严重医院感染事件通报 — 1. 关于深圳市某医院发生严重医院感染事件的通报 2. 卫生部关于安徽省某立医院恶性医疗损害事件的通报 3. 关于西安交通大学医学院某医院发生严重医院感染事件的通报 4. 关于山西省太原某中心医院血液透析感染事件的通报 5. 关于天津市蓟县某院新生儿医院感染事件的通报 6. 卫生部关于安徽省某县医院血液透析患者感染丙肝事件的通报 7. 关于广东省汕头市潮阳区某中心卫生院剖宫产患者手术切口感染事件的
（4）报告：报告时应采取分级报告的方式。 报告方式：
- 300个不同视野未找到抗酸杆菌 + - 300个视野发现1-2条抗酸杆菌 1+ 100个视野发现1-9条 2+ 10个视野发现1-9条 3+ 每个视野发现1-9条 4+ 每个视野发现9条以上
荧光染色法：
（1）涂片：方法同抗酸染色
（2）染色：①涂片自然干燥后火焰固定；②滴加 染色剂染色30分钟③滴加脱色剂脱色致无色； ④滴加复染液复染1-2分钟；⑤镜检。
结核分枝杆菌革兰染色阳性,无鞭毛、无芽孢、 无菌毛，近年来发现在细菌外有一层荚膜， 一般制片，在普通光学显微镜下不易看到， 经特殊制片后，在电镜下可以看到。
三、生物学特性
1.本菌为典型的抗酸杆菌, 所以需用抗酸染色法， 齐-尼染色法是常用的抗酸染色法。
生物学特性
2.用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下菌体 呈橘黄色
三、生物学特性
〈二〉培养特性
懒——生长缓慢 馋——营养要求高 丑——菌落粗糙，像菜花样
三、生物学特性
〈三〉变异性
结核分枝杆菌易发生形态 菌落 最适生长温度 毒 力以及耐药性变异，BCG就是牛型结核分枝杆菌 毒力变异株，它是将牛型结核分枝杆菌接种在含 甘油、胆汁、马铃薯的培养基中，经过13年230 次传代得到的减毒菌株。另外发生耐药后菌株毒 力也会减弱。
• 调查：20份切口分泌物标本培养出龟分枝杆菌（脓肿亚型）。医院环境和 无菌物品细菌学检查合格。使用中和未启用的戊二醛半小时不能杀灭金葡 菌、1小时不能杀灭龟分枝杆菌，测浓度为0.137%。
（2） 方法：取5uPPD或OT0.1ml注射于前臂掌侧皮下，经 48-72小时检查反应情况。应特别注意局部有无硬结，不 能单独以红晕为标准。
（3）结果分析：
阳性 注射部位硬结 红肿直径0.5-1.5cm之间。这表明机 体曾感染过结核，出现超敏反应，但不表示患结核病；
强阳性 硬结直径超过1.5cm以上,表明可能有活动性结核, 应进一不检查;
〈五〉其它检验方法
〈1〉鉴别培养基法（手工法） 〈2〉PCR反向膜探针杂交ELISA法（PCR杂交法） 〈3〉DNA探针 〈4〉16SrRNA基因序列测定 〈5〉高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸 〈6〉核酸检测 用PCR法快速诊断结核分枝杆菌感染
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第二节 非结核分支杆菌
一、分类
不产色菌 光产色菌 暗产色菌
2 鉴定试验：近年来由于AIDS的急剧增加，使得 非结核分枝杆菌引起的AIDS合并分结核分枝杆菌 病不断出现。因此必须对临床分离出的分枝杆菌 做菌种鉴定，为结核病和非结核分枝杆菌病的临 床鉴别和防治提供科学依据。
〈四〉免疫学检验
1 结核菌素试验
（1） 原理：结核菌素有两种，一为旧结核菌素（OT）其 中主要成分为旧结核菌素，即结核分枝杆菌蛋白，现已不 用。另一种为纯蛋白衍生物（PPD），每0.02μg为1u。 注入皮内后如受试者已感染结核，则结核菌素与致敏淋巴 细胞特异性结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发型超敏 反应性炎症，若受试者未被感染过结核则无反应。
结核病
古老的疾病 全新的疾病
二 、临床意义
据WHO估计，若不加强控制，20002020年间会有10亿新发感染者，2亿人发 病，3500万人将死于结核病，因此应引 起人类足够重视。
二 、临床意义
<一>致病物质
索状因子 磷脂 硫酸脑苷脂 蜡质D
二 、临床意义
<二>所致疾病及临床表现
人型结核分枝杆菌主要通过呼吸道 消化道和损伤 的皮肤等多途径感染机体，引起多脏器组织的结 核病,头发和指甲除外,其中以肺结核为多见。
（3）镜检：荧光染色后抗酸杆菌菌体呈黄绿色或 橙色荧光。
（4）报告：
-
0条/70视野
+ -（可疑） 70个视野发现1-2条抗酸杆菌
1+
50个视野发现2-18条
2+
每10个视野发现4-36条
3+
每个视野发现4-36条
4+
每个视野发现36条以上
〈三〉分离培养与鉴定
1 分离培养：分固体培养基培养法和液体培养基培养法（仪 器法）
二、临床意义
二、临床意义
(四)耐药性
对常见抗菌药物天然耐药 多 重 耐 药 结 核 病 (multiple-drug resistance
tuberculosis，MDRTB)是指对2种或2种以上的抗结核 药产生耐药性的结核菌感染。临床治疗相当棘手，死亡 率很高
三、生物学特性
<一>形态与染色 结核分枝杆菌典型的形态是直或略带弯曲、两端钝圆、 菌体细长杆菌,有时可见分枝状,约为1-4UM*0.30.6UM,牛型比人型短而粗。单个散在或成分枝状排列， 菌体常扭集一起呈绳索状、束状或堆积成团。
通报 ———摘自江苏省卫生厅《严重医院感染事件通报与处罚规定选编》
（2010年7月）
二、临床意义
脓肿分枝杆菌引起的注射后感染
二、临床意义
难于愈合的伤口
脓肿分枝杆菌引起的注射后感染
潮湿治疗室曾导致肌肉注射感染
某医院手术切口分枝杆菌感染暴发 （广东深圳，1998）
• 表现： 1998年4月1日～5月31日共手术292例，4月22日～7月14日发生切 口感染166例。潜伏期为20～30天。切口部位开始为小结节，继而化脓成 窦道，有线头挟出。清创换药后创面清洁但不愈合，或愈合后又复发，并 有淋巴结炎倾向。
结核分枝杆菌在体内外多种因素作用下，可出 现细胞壁缺损，均可导致L型。可出现形态多样 性，亦可致抗酸染色阴性。
三、生物学特性
〈四〉抵抗力
对理化因素抵抗力较强，耐干燥，在干燥痰内可存 活6-8个月，含有结核杆菌的痰液尘埃经8-10天仍有传染 性。此菌对化学消毒剂的抵抗力较一般细菌强，在 3%HCl、6%H2SO4 或4%NaOH中不被杀死。对湿热敏 感，62-63℃15分钟可杀死细菌，95℃一分钟可杀死细 菌。光照2小时可杀灭纯培养物，结核患者的衣物 30W 紫外线灯距离1M，照射20分，能净化物面和空气中的结 核杆菌。70%的乙醇中2分钟即被杀死。
一、分类
结核分枝杆菌复合群主要包括结核分枝杆菌， 牛分枝杆菌，牛分枝杆菌BCG，非洲分枝杆菌， 田鼠分枝杆菌等，结核分枝杆菌感染的发病率 最高，占90%以上，牛型占3-16%，区域差别 各地报道不尽一致。
二 、临床意义
结核分枝杆菌简称结核杆菌，是人 和动物结核病的病原菌
二 、临床意义
目前全球约有三分之一 的人口感染结核分枝杆 菌，每年约有300万人死 于结核病，仅我国每年 约有25万人死于结核病。 近年AIDS发病率呈上升 趋势，且AIDS患者易感 染结核，因此WHO已经 将结核病与AIDS、疟疾 一起列为人类最主要杀 手。
〈1〉固体培养基培养法 A 常用的前处理液为2-4%NaOH、N-乙酰-L-半胱氨酸、苯
扎氯铵、草酸。 B 前处理的目的：痰液液化，杀死杂菌，保留抗酸杆菌。 C培养基的选择：罗琴氏培养基
D 接种：前处理后的标本，接种于两支固体培养基 上，每支培养基接种量为0.1ml，要把标本均匀地 接种到整个培养基斜面上，然后平置，培养基斜面
G报告方式
分枝杆菌培养阴性 无菌落生长 分枝杆菌菌落数XX个 20个菌落以内 分枝杆菌培养阳性<1+> 菌落占斜面面积1/4 分枝杆菌培养阳性<2+> 菌落占斜面面积1/2 分枝杆菌培养阳性<3+> 菌落占斜面面积3/4 分枝杆菌培养阳性<4+> 菌落呈菌苔样生长者
<2>液体培养法;就是用液体培养基,利用细菌快速 培养仪对结核杆菌的快速培养,不同的培养仪,前 处理方法不同,培养基不同,检测原理不同.
分枝杆菌属细菌细胞壁 含有大量脂类分枝菌酸， 不易为革兰染液着色， 但一般认为是革兰阳性 菌。在加热和延长时间 后可以使菌体着色，且 它具有抗酸性，一旦着 色后能抵抗盐酸酒精的 脱色作用，故又名抗酸 杆菌。
痰涂片抗酸染色结果
主要内容
结核分枝杆菌复合群 麻风分枝杆菌 非典型分枝杆菌
第一节 结核分枝杆菌复合群
继发感染亦称复活感染，已痊愈的原发感染可以 复活，成为活动性结核病。约三分之二的结核病 是继发感染所致，且多发于25岁以上者。
二、临床意义
<三>免疫性
人类对结核分枝杆菌的感染率甚高.但发病率不 高,这表明人体对结核分枝杆菌有相当强的免疫 力,结核的免疫为有菌免疫或称传染性免疫,这种 免疫系指结核分枝杆菌或BCG进入机体后使机 体对细菌再次入侵有免疫力,而当细菌和其它成 分从体内彻底消失后,机体的免疫力也随之消失.
朝上培养于35℃、5-10%CO2温箱中，24小时后直 立。
E 观察：接种后第一周每天观察一次，以后每周 观察一次至第8周，若培养8周，仍未有抗酸杆菌 生长者，即可判断培养阴性。如果出现生长缓慢、 干燥、呈颗粒状灰白色菌落，涂片染色为抗酸菌 阳性则多数是结核分枝杆菌。若菌落有色素产生 同时菌落为光滑型，且多不典型，可能为非典型 分枝杆菌，则需要接种于24-33℃继续培养至12 周，或通过菌型鉴定技术进行鉴定。
漂浮集菌法：取晨痰或12-24小时痰液约10ML 于50-100ML玻璃瓶中，加入等量2-5%氨水或 其它淡碱性溶液，高压灭菌15分后，待冷，加入 汽油0.3ML，放入振荡器上震荡10分取出，加蒸 馏水至满瓶口，将已涂抹蛋白甘油固定剂且已编 号的载物片盖于瓶口上，静置20-30分，翻转玻 片，火焰固定，染色镜检。