非禽源细胞及其制品外源病毒检验操作规程

SYZY075-2013 非禽源细胞及其制品外源病毒检验操作规程

1 目的

该SOP用于规范非禽源细胞、毒种及其制品的外源病毒检验。

2 适用范围

该SOP适用于非禽源细胞、毒种及其制品的外源病毒检验。

3 职责

进行该项检验的检验员应当按该SOP进行检验，检测室负责人负责监督该操作规程的正确执行。

4 检验

4.1 实验材料/仪器设备

4.1.1 待检样品（2～3瓶/批，另有规定除外）、0.25%EDTA胰蛋白酶溶液、DMEM或MEM培养液、PBS （pH7.2）、胎牛血清（或新生牛血清）、双抗（首先配制成青霉素100000U/ml、链霉素100000µg/ml浓度贮存液，－20℃保存，使用时终浓度分别为100 U/ml、100µg/ml）、0.2%豚鼠红细胞、0.2%鸡红细胞、特异性阳性血清、吉姆萨染色剂或其它适宜染色剂、阳性对照用毒种（根据需要选用）、牛病毒性腹泻病毒/粘膜病病毒（BVDV，Oregon C24V株、NADL株或其它毒株）、猪细小病毒（PPV，NADL-2株、7909株或其它毒株）、猪瘟病毒（CSFV，Thiverval株或其它毒株）、蓝舌病病毒（BTV，暂无）、狂犬病毒（RV，CVS-11株）、犬细小病毒（CPV，CPV-DD株）、马传染性贫血病毒。

4.1.2 恒温培养箱、CO2 培养箱、－70℃低温冰箱及普通冰箱、低速离心机、普通显微镜\荧光显微镜、水浴锅、25cm2细胞培养瓶、吸管（1ml，5ml，10ml）、多孔细胞培养板。

4.2 检验步骤

4.2.1 样品处理取样品。对毒种或活疫苗进行检验时，将样品混合，其中疫苗制品1ml稀释液中应至少含10头份（另有规定除外），8000g离心10min后取上清备用；对细胞（培养面积需大于75cm2）进行检验时，经3次冻融后混合作为检品。毒种和活疫苗样品的具体处理如下：

4.2.1.1 如毒种或疫苗病毒不感染所选用的细胞或对所选用的细胞不产生细胞病变和不引起红细胞吸附时，不进行血清中和。

4.2.1.2 需要中和的样品，选择单特异性血清进行中和，如对检品中病毒中和不完全时，

可用效价更高的血清重做，或根据病毒特性，适当对毒种或疫苗进行稀释，但接种量最低不得低于1头份；或用制品使用对象进行检验。不同疫苗处理方法见表1。

表1 不同样品处理方法

4.2.2 细胞的选择细胞选择原则：每一种被检样品应接种以下细胞：（1）绿猴肾（V ero）传代细胞；（2）疫苗靶动物的胚胎细胞，或新生动物细胞，或细胞系。不同检查方法具体的细胞选择详见表2。

表2 不同非禽源细胞及其制品外源病毒检验法选用的细胞

注：（*1）对于猪瘟活疫苗荧光抗体检测法中对BVDV的检验应选择BT或MDBK细胞。（*2）牛、绵羊和山羊制品如污染BTV，可引起Vero的CPE，通过致细胞病变检查法检出外源BTV。（*3）马传染性贫血病毒暂无相关活疫苗。

4.2.3 样品的接种和培养

4.2.3.1 样品的接种不同检验方法选择不同的细胞进行检验，详见表2。

按 4.2.1方法处理好的样品接种已长成良好单层细胞的25cm2 细胞培养瓶或同步接种（如荧光抗体检查法中对猪细小病毒的检测需要同步接毒）25cm2 细胞培养瓶。接种剂量为至少1.0ml已处理的被检样品（另有规定除外）。接种后37℃吸附1h，然后弃去接种物，用PBS或细胞营养液洗涤细胞表面2次，然后加10ml含1～2％胎牛血清（或新生牛血清）细胞培养液继续培养。另设正常细胞对照至少1瓶。

4.2.3.2 细胞培养物的继代

将上述每种细胞培养物冻融3次后，3000rpm离心10分钟，取上清液接种于新的相应细胞单层用于继代。每次继代均设立正常细胞对照。待检样品在每种细胞上的总培养时间应不少于14日，培养期间细胞培养物应至少继代1次。

最后一次继代的细胞单层数量和面积、培养时间应符合荧光抗体检查法、致细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求。可供选择的培养器皿、数量及接种剂量参考表3。

表3 选择使用的接种器皿、数量及接种量

4.2.3.3 培养期观察培养期内在显微镜下观察细胞病变情况。正常细胞对照未出现细胞病变则试验成立，如被检样品细胞出现非疫苗病毒引起的细胞病变时，则判为不符合规定；

如无细胞病变，培养结束时，细胞单层应按下述方法继续检验。如正常细胞对照出现细胞病变，则试验不成立，需重检。

4.3 检查方法

4.3.1 荧光抗体检查法

4.3.1.1 荧光抗体及细胞的选择和准备

根据不同的制苗细胞来源或靶动物，选择不同的检验细胞（见表2）。按步骤4.2.3进行样品的接种与培养。

最后一次继代的细胞单层培养5～7日后用于荧光抗体检查。每种细胞按照表2中列出的待检外源选择特异的抗病毒荧光抗体进行检测。

对每一种特定外源病毒的检验至少包含三组细胞单层：（1）被检样品细胞培养物；（2）最后一次继代时接种100～300FAID50特定病毒的阳性对照；（3）正常细胞对照。

每一组细胞单层检查面积应不小于6.0cm2 。以下步骤以接种48孔细胞培养板为例。

4.3.1.2 方法

待检细胞培养板或飞片在培养箱中培养5～7日后，弃掉营养液，用PBS（pH7.2）洗涤2～3遍，晾干后滴加－20℃预冷的80%丙酮水溶液，置2～8℃固定30分钟，弃去固定液，自然干燥。

可根据实际情况，选择直接免疫荧光检查法或间接免疫荧光检查法。

4.3.1.2.1 直接免疫荧光检查法

（1）用PBS（pH7.2）洗涤固定好的细胞单层1次，1ml/孔，静置3分钟后弃去洗涤液。

（2）将针对待检外源病毒的FITC标记的单特异性抗体稀释到合适的工作浓度，加入到上述细胞单层上，0.2ml/孔，37℃孵育60±10分钟。

（3）弃去荧光抗体，用PBS（pH7.2）洗涤3次，1ml/孔，每次静置3分钟。

（4）最后在倒置荧光显微镜下用蓝色激发光（波长490nm）观察。

4.3.1.2.2 间接免疫荧光检查法

（1）用PBS（pH7.2）洗涤固定好的细胞单层1次，1ml/孔，静置3分钟后弃去洗涤液。

（2）将针对所检外源病毒的单特异性抗体稀释到工作浓度，滴加到上述固定好的细胞单层上，0.2ml/孔，37℃孵育60±10分钟。

（3）弃去抗体，用PBS（pH7.2）洗涤3次，1ml/孔，每次静置3分钟。

（4）加入相应工作浓度的FITC标记的二抗，0.2ml/孔，37℃孵育60±10分钟。

（5）弃去二抗，用PBS（pH7.2）洗涤3次，1ml/孔，每次静置3分钟。