3-4、溶菌酶的制备实验

生产方法
以蛋清为原料，在pH6.5条件下，用 弱酸性阳离子交换树脂732（724）吸附后，再 用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得产品。 从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个 氨基酸残基构成的单一肽链。
溶菌酶的作用机理
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，它主要作 用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间 的β-1，4键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，从 而破坏细菌的细胞壁，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌 溶解，失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。 溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、 脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、 消炎、抗病毒等作用。 通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌， ： 菌悬浮液═ 溶菌并澄清。
实验目的
掌握从蛋清中分离提取溶菌酶的工艺和方法； 了解溶菌酶的物理化学性质；
主要仪器设备和药品
（1）耗材：pH试纸、500mL烧杯、100mL 烧杯、玻璃棒、60-80目筛子、200mL量 筒、滤纸、布氏漏斗、抽滤瓶、透析袋、 pH试纸碱性、pH试纸酸性、50mL离心管 （2）试剂：鸡蛋5个、724树脂50g、磷酸二 氢钾、氢氧化钠固体、硫酸铵、浓盐酸、固 体氯化钠、丙酮、磷酸二氢钾 （3）仪器设备：电动搅拌器、冰箱、真空泵、 真空干燥箱
溶菌酶的制备（3-4）8学时
溶菌酶的性质
（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰 胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase）， 是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。 是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳 香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮， pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存 在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活 力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十 二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在 281.5nm处的吸光系数为26.4。
溶菌酶的用途
用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病 的治疗。 直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏 阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和 多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间 的β-1，4键联结的。 对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶 的破坏。 溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道 而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆 菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收
思考题
1.讨论影响溶菌酶得率的因素？ 2.试分析提取溶菌酶所需要树脂的选择原则？ 3.树脂724是阴离子还是阳离子交换树脂？是酸性 还是碱性？ 4.溶菌酶的化学性质？ 5.溶菌酶的特点（优点）？ 6.溶菌酶的作用机理？
6）盐析：向澄清透析液中慢慢滴加1mol/L氢氧化 钠，同时不断搅拌，pH上升到8.5-9时，如有白色 沉淀，立即离心除去。在搅拌中加入3mol/L盐酸， 使溶液pH达到3.5，按体积缓缓加入5%固体氯化 钠，即有白色沉淀析出。在0-5℃放置48h，离心 或过滤得溶菌酶沉淀。 7）干燥：沉淀加入10倍量(冷至0℃)的无水丙酮， 不断搅拌，冷处静置数小时，用漏斗滤去丙酮，将 沉淀置于真空干燥箱（室温）干燥，称重，计算溶 菌酶得率。
4）洗脱：取0.15mol/L（pH6.5）磷酸缓冲液150mL， 分3次加入树脂中，搅拌约为15min，每次搅拌后减压抽 滤去水分；用10%硫酸铵200mL，分4次洗脱溶菌酶， 每次搅拌30min，过滤抽干，合并洗脱液，按总体积加 入32%（质量体积比）固体硫酸铵使含量达到40%，有 白色沉淀产生。冷却放置过夜，弃上清，沉淀离心分离 （或抽滤），得粗制品。 5）透析：将粗制品溶解于50ml蒸馏水，装入透析袋， 0-5 ℃透析24-36h。
百度文库 实验方法
原料处理 吸附 去杂蛋白 洗脱
沉淀
干燥
盐析
透析
方法步骤
1）制备蛋清：将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞， 使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟， 使鸡蛋清的稠度均匀，用铜筛过滤除去脐带块等其他杂质， 量体积约为100mL。 2）吸附：温度降至5 ℃左右，边搅拌边加入处理好的724 树脂50g（湿重），使树脂全部悬浮于蛋清中。保持0-5摄 氏度，搅拌吸附5h，将蛋清在0-5 ℃静置过夜。 3）去除杂蛋白：把上层清液渐渐倒出，下层树脂用清水洗 去吸附的蛋白质，反复4次，将树脂抽滤去水分。
（4）溶液配制： 1）0.15mol/L（pH6.5）磷酸缓冲液：取磷酸二氢钾6.8g,加 0.1mol/L氢氧化钠溶液152mL，用水至1定容到1L，即得； 每组150mL。 2）0.1mol/L氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠固体放入烧杯中,用 800mL左右蒸馏水溶解，冷却后用蒸馏水定容至1L，即得； 每组160mL。 3）10%硫酸铵溶液：称取无水硫酸氨100g，用800mL水溶 解，用蒸馏水定容至1L，即得；每组200mL。 5）1mol/L氢氧化钠溶液：40g氢氧化钠固体放入烧杯中,用 800mL左右蒸馏水溶解，冷却后用蒸馏水定容至1L，即得。 6）3mol/L盐酸溶液：量取100mL浓盐酸加入300mL水中， 混合均匀即得。
溶菌酶的特点（优点）
（1）溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C型，是 已知的最耐热的酶； （2）溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌 酶的活力可全部恢复； （3）溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定； （4）溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐； （5）溶菌酶生产成本较低； （6）溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+ 菌，对部分G-菌也有抑制效果； （7）溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年 FAO/WTO 的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。