流感禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测

标准操作规程（SOP ）

中国国家流感中心

流感/禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测

一、目的 该文件是为流感/禽流感抗体检测、鉴定的血清学试验制定，用以说明红细胞凝集抑制试验用于血清抗体检测的操作过程和规范，确保红细胞凝集抑制试验的操作过程符合规范，确保抗体检测结果可信、滴度准确。

二、范围

适用于中国国家流感中心所有技术人员进行流感/禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测。

三、程序

（一）生物安全要求

H5、H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。

（二）材料

1．抗原：

季节性流感病毒：人群中常见流行的流感病毒如A （H1N1）、A （H3N2）、B 型流感病毒的标准参照抗原；抗原制备需要在BSL-2实验室进行，操作人员穿工作服、工作鞋，戴手套、帽子、口罩。抗原制备、灭活见《流感/禽流感灭活抗原的制备和纯化SOP 》 和《β-丙内酯病毒灭活SOP 》。 禽流感病毒：灭活的H5N1亚型流感病毒。抗原制备需要在BSL-3实验室进行，操作人员穿双层工作服、戴双层手套、帽子、口罩、防护目镜以及工作鞋。抗原制备、灭活见《流感/禽流感灭活抗原的制备和纯化SOP 》 和《β-丙内酯病毒灭活SOP 》、《多聚甲醛病毒灭活SOP 》，灭活后的抗原可在BSL-2实验室内操作。

2．血清：

（1）季节性流感参比血清： 编号：CNICSOP07034 制定时间：2007.01 制定人：王敏 梁倩 审核人：白天 董丽波 批准人：舒 跃 龙 生效日期：2007.03 版本号：V-2

A（H1N1）亚型标准抗血清

A（H3N2）亚型标准抗血清

B型Yamagata系标准抗血清

B型Victoria系标准抗血清

血清取用需要在BSL-2实验室生物安全柜内进行。

（2）季节性流感待检血清：需急性期和恢复期双份血清，血清取用需要在BSL-2实验室生物安全柜内进行，相关操作见《临床标本的接收和保存

SOP》。

（3）禽流感参比血清：由H5N1毒株制备的鸡血清，相关操作见《流感/禽流感鸡血清制备SOP》。

（4）疑似禽流感病例待检血清：需急性期和恢复期双份血清，血清取出需要在BSL-3实验室生物安全柜内进行，相关操作见《临床标本的接收和

保存SOP》。

3．其他试剂：

（1）红细胞悬液：常用鸡、豚鼠、马红细胞悬液。红细胞悬液制备按照相关红细胞制备SOP进行。

（2）磷酸缓冲液（PBS），0.01M，pH 7. 2

将1包PBS粉剂（Sigma）溶于1000mL去离子水中。121℃高压灭菌，至4℃保存，保存期为3周。

（3）生理盐水：0.85% NaCl

4．其他：

96孔微量板：“U”型底微量板、”V”型底微量板（Corning）

37℃水浴锅

56℃水浴锅

台式离心机

多道可调加样器

离心管

（三）实验步骤

1．按《血清处理SOP》处理血清。

2．按下表所列条件选择红细胞凝集板和实验条件。

流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较

红细胞鸡豚鼠马

流感病毒禽流感病毒适用范围流感和禽流

感病毒

终浓度（％）0.5 0. 5 0.5

孔底部形状U或V型U型U型

孵育时间30min 60min 60min

细胞对照细胞沉积成

细胞沉积成环状细胞沉积成环状

圆点状，倾斜

时细胞向下

流成泪滴状，

注：由于“O”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞。

3．红细胞凝集试验（HA）检测参比抗原滴度，具体操作见《流感/禽流感病毒红细胞凝集抑制试验鉴定SOP》。

4．制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原，具体操作见《流感/禽流感病毒红细胞凝集抑制试验鉴定SOP》。

5．红细胞凝集抑制试验（HI）检测血清抗体

（1）流感鉴定常用的4种参比抗原：

1）A（H1N1）亚型代表毒株参比抗原

2）A（H3N2）亚型代表毒株参比抗原

3）B型Yamagata系代表毒株参比抗原

4）B型Victoria系代表毒株参比抗原

禽流感鉴定抗原：采用国家流感中心提供的参比抗原。

（2）流感血清抗体鉴定：

根据所用红细胞选用适当的微量板，须设立血清对照板。

将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方

向称行，如A1～A12称为A行。标记好待检病毒的实验室编号及加样

顺序。

1）除A行外，每孔加入25μL PBS缓冲液。

2）按以下顺序，在A行各孔加入处理过的血清50μL。

A1：待检血清标本1，急性期血清

A2：待检血清标本1，恢复期血清

A3：待检血清标本2，急性期血清

A4：待检血清标本2，恢复期血清

A5：待检血清标本3，急性期血清

A6：待检血清标本3，恢复期血清

A7：待检血清标本4，急性期血清

A8：待检血清标本4，恢复期血清

A9：A（H1N1）亚型标准抗血清

A10：A（H3N2）亚型标准抗血清

A11：B型Yamagata系标准抗血清

A12：B型Victoria系标准抗血清

3）用多道加样器从A行各孔分别吸取25μL血清，由A行至H行进行2倍稀释血清，弃去H行最后25μL液体。

4）红细胞凝集抑制试验板每孔加入25μL新配制的4个凝集单位的抗原。5）血清对照板每孔加入25μLPBS。

6）轻轻弹击微量板，使抗原与抗体充分混合。

7）室温孵育20min。