流感禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测
高致病性禽流感红细胞凝集(HA)与凝集抑制(HI)
高致病性禽流感红细胞凝集(HA)与凝集抑制(HI)试验1.原理：禽流感病毒具有凝集鸡的红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(Hl)试验，具有特异性。
通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
2.用途：用于禽流感病毒的血凝素亚型鉴定和抗体检测。
3.试剂：禽流感病毒标准抗原、禽流感标准阴、阳性血清、阿氏液、1%的鸡红细胞、pH7.2的磷酸盐缓冲液。
4.设备耗材：普通天平、分析天平、普通离心机、微量振荡器、微量移液器、高压灭菌器、微量移液器、V形血凝反应板、吸头等。
5.操作步骤6.1血凝试验：5.L1取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔〜12孔每孔加25μLPBS;5.L2吸取25μL病毒悬液加入第1孔中，吹打3〜5次充分混匀；5.L3从第1孔中吸取25uL混匀后的病毒液到第2孔，混匀后吸取251IL加入到第3孔，依次进行倍比稀释至第11孔，最后从第11孔吸取25UL弃之，设定第12孔位PBS对照；每孔再加入25μLPBSo5.1.4每孔加入25μLl%的鸡红细胞悬液（用前将鸡红细胞悬液充分混匀）；振荡混匀反应混合液，室温（20-25。
C）静置40min后观察结果。
5.L5结果判定：在PBS对照出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝集，以完全凝集的病毒最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度。
完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。
5.2血凝抑制试验：1.1.11配制4单位抗原：根据血凝试验结果配制4单位抗原，以能引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位，4血凝单位抗原即为最高稀释倍数除以4。
加入抗原的血凝滴度为1:256,则4HAU抗原的稀释倍数为1:64,即ImI抗原加入到63mlPBS中即为4HAU 抗原；1.1.2取96孔V形微量反应板，用移液器在第1〜11孔各加入25ULPBS,第12孔加入50ULPBS；1.1.3第1孔加入25UL新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出25μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25μL,第11孔做阴性对照，第12孔为PBS对照。
禽流感血凝和血凝抑制试验操作
禽流感血凝和血凝抑制试验操作鲁卫红/甘肃省临夏州动物疫病预防控制中心 731100摘 要：当前，血凝和血凝抑制试验是检验与监测禽流感最常用的方法.随着养殖户科学养殖意识的逐渐增强，越来越重视实验检测技术在养殖业中的运用。
其中，血凝和血凝抑制技术是养鸡业中最常用的免疫实验检测技术之一。
该项技术主要运用于鸡新城疫和禽流感病毒日常检测和专项监测，其目的在于明确鸡的免疫状态，从而科学合理地控制、预防传染病。
为提高血凝和血凝抑制试验操作的精准性和规范性,笔者结合自身多年的工作经验，总结了该项试验的操作要点。
关键词：禽流感；血凝；血凝抑制；试验操作1 实验操作准备要点1.1 标本处理和保存 血凝和血凝抑制试验主要以静脉血为主。
要使实验室诊断得出正确结果，采集静脉血后需要及时做血清分离，保证血清清透无溶血。
通常是分离后及时检测，如果不能及时检测，待检血清在4℃冷藏环境中保存不超过5d，如果待检时间超过一周，需要保存在-20℃冷冻环境中，检测时取出自然融化，避免血清反复冻融影响效价。
1.2 稀释液配置 血凝和血凝抑制试验中所用的PBS稀释液必须遵循“现配现用”的原则，严格控制PBS液的PH值确保PH7.0～7.2。
1.3 1%红细胞悬液制备 需要选取3～5只常规实验证明体内无禽流感病毒抗体的健康公鸡，最大限度的避免公鸡红细胞发生自凝现象。
翅下静脉血采集到加有抗凝剂的试管中并上下颠倒混匀，待采集样本在离心操做中缓慢加入PBS液混合，按2000r/min的离心5min，反复三次离心即可，每次离心结束后都吸出上层溶液和白细胞膜弃去，制成红细胞泥加入阿氏保护液，4℃冷藏保存备用，不超过5d。
整个制备过程中避免用力太大引发红细胞破裂出现溶血现象，临用时用PBS液制成1％红细胞悬液，每次实验结束后剩余的1％红细胞悬液应弃去，切勿保留至下次再用。
注意：最终配置好的悬液静放后出现了红色上清液，是出现了溶血现象，此时的红细胞悬液不可用。
血凝试验和血凝抑制试验用于禽流感抗体检测
中 ，标 记清 楚 ，离 心 后 吸 出血 清 ，对 应 编号 冷藏 送 检 ，并 禁 止运 清 液 ，反复几 次 ，直 至上 清液清 亮透 明为 止 。 ④ 在 加红 细胞 过 程 中 ，还须 不 断轻 摇 ，以确保 红 细胞 均 匀 ， （ ２ ）一 般情 况 下 ，在５ ｄ 内检 测 的 样 品可 放 置 在４ ℃的 冰箱 使 其每 孑 Ｌ 加 入相 同数 量 的红细胞 。 ⑤ 制 备好 的红 细胞 液如 果 放置 后上 清 液变 红 ，说 明有 溶 血 ， 中冷 藏 ，否则 ，低 温冷 冻 保存 。 （ ３） 在检 测 前血 清样 品应 充 分混 匀 ，混匀 时采 用上 下缓 慢颠 不 可再 使用 。
倒 几 次 的方 法 即 可 ，切 忌剧 烈 振荡 ，引 起产 生气 泡 及 血清 中蛋 白 ５ 抗原 液 的 配制 变性。 ① 先 做血 凝试 验 测定 效 价 ， 以抗原 与红 细 胞完 全 凝集 的 孔为 心 的方 法有 助 于缓 解 该状 态 。胶 状 物 是含 纤 维蛋 白和纤 维 蛋 白原
中国畜牧兽医文摘
２ ０ １ ４ 年
３ ０ 卷
第８ 期
基 础 科 学
血凝试验和血凝抑 制试验 用于禽流感抗体检测
常耀祖 杨 永春 施进 文
７ ５ １ ３ ０ ０ ） （ 宁夏 同心县动物疾病预 防控制 中心 ，宁夏吴忠
近 年 来 ，高 致 病性 禽 流感 疫 情 在世 界 各地 均 有发 生 ，人感 染 高 致 病性 禽 流 感 的事 件越 来 越 多 。预 防高 致 病性 禽 流感 已成 为全 ④全 部试 验均 采用 同一 种稀 释液 。 （ ３ ）１ ％红细胞 制备 的注意事 项 ① 为 避 免 鸡 只红 细 胞 发 生 自凝 现 象 ，在 配 制 １ ％红 细胞 悬 液
禽流感血凝试验记录表1
禽流感血凝、血凝抑制试验试验记录表样品名称：鸡待检血清样品数量：16份接样日期：2012年4月18日检测日期2012年4月18日免疫日期：年月日免疫疫苗类型：采样日期2012年4月18日检测项目：禽流感抗体检测方法依据：高致病性禽流感诊断技术试剂来源：青岛易邦生物工程有限公司有效12个月试验操作：一、实验准备：1、96孔V型微量血凝反应板2、涉及仪器：25uL8道、25uL单道、微量振荡器3、阿氏液的配置：葡萄糖 2.05g 枸橼酸钠（5H2O）0.8g枸橼酸0.055g 氯化钠0.42g蒸馏水加至100ml，过滤分装，高压蒸汽灭菌115℃10分钟，4-8℃保存。
4、稀释液（PBS）配置：（0.2moL/L PH7.0-7.2磷酸缓冲盐水）磷酸二氢钾13.6g 氢氧化钠 3.0g氯化钠170.0g蒸馏水加至1000ml，过滤分装，高压蒸汽灭菌121℃20分钟，4℃保存，使用时以蒸馏水作20倍稀释。
5、1%鸡红细胞悬液：采取3-4只无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡血液，放入倍量的阿氏液中混合均匀，4℃保存可用一个月。
使用前取红细胞悬液一份注入离心管中，经2000转/分钟离心3-4分钟，用吸管吸出上清液和上层的红细胞薄膜，沉淀的红细胞用PBS稀释液洗涤3-4次，每次以2000转/分钟离心3-4分钟，最后一次离心5分钟，弃上清液，将离心后的红细胞压积，按刻度或用吸管吸取一定量，加入PBS稀释液，配成1%鸡红细胞悬液。
6、禽流感病毒H5亚型血凝试验抗原7、被检血清二、血凝试验（HA）（-）实验步骤：（二）抗原血凝效价判定：环境条件：室内：温度24℃湿度：10%三、血凝抑制试验（HI）（二）试验结果判定：环境条件：室内：温度24℃湿度：10%。
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亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座
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实验原理
1、HA原理：一些病毒或病毒血凝素能选择性地使 某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞现象 称为血凝（HA）,也称直接血凝反应（红细胞不流 淌）。
病
毒
红
颗
细
粒
胞
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2、HI原理：当病毒悬液中加入特异性抗体，且这种 抗体量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表 面受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红 细胞凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI） 反应，也称血凝抑制反应。
8、微量反应版假如是有机玻璃一定要清洗洁净，孔底要
透亮，无磨损毛糙无划痕和有残留物。不洁净反应板在试验中会 出现自凝现象。使用正规厂家生产一次性微量板就可杜绝这种情 况。
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注意事项
9、整板无红细胞凝集（流淌）现象，给人误认为抗体效价均为 12。原因分析：1、 4个单位抗原配制过低不足以凝集红细胞；2、环 境温度过高；3、读数时间拖延；4、没有加4个单位抗原。
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禽流感血凝血凝抑制试验的质量控制
禽流感血凝-血凝抑制试验的质量控制禽流感血凝-血凝抑制试验是目前我国各地动物防疫监督机构、出入境检验检疫部门和养殖场对禽鸟进行禽流感疫苗抗体水平监测广泛采用的试验方法。
该试验方法具有经济、快速可靠、操作简便和对抗体水平进行量化的优点，能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽类血样的禽流感抗体滴度水平，但试验的结果受操作技术的影响很大，试验过程中的质量控制十分关键。
1 样品的采集和处理1.1 样品的采集气温在23 ℃以上时，采集完的活禽血样在2 h内就可以析出清亮的血清。
但在气温为10 ℃左右的时候，采集完的活禽血样的血清很难自然析出，最好立即将采样针筒放入37 ℃培养箱中孵育2～3 h，便可见血清析出。
1.2 待检血清的处理一般情况下，在5 d内测定的血清样品可放置于4 ℃的冰箱中冷藏，样品待检时间超过1周的，需低温冰冻保存。
1.3 冻结血清的处理冻结血清融化后，会出现蛋白质局部浓缩、分布不均的现象。
在检测前应充分混匀，混匀时宜轻缓，避免产生气泡以及因剧烈的振荡而引起血清蛋白的变性，可采用上下颠倒5次的混和方式。
检测样品还应避免过多的冻融周期，以防样品抗体受损害，建议不超过3～5个周期。
对于切实需要多次分批检测的，可将血清样品分装。
1.4 非特异性凝集素的处理在该试验中鸡血清极少出现非特异性阳性反应，没有必要在试验前对血清进行预处理。
除鸡外，有些禽（如水禽、鸽子）的血清可能对鸡红细胞产生非特异性的凝集，这种特性的确定可用待检血清做血凝试验，如果待检血清也出现凝集红细胞的现象，则说明有非特异凝集素存在，需用鸡红细胞对待检血清进行吸附，以除去非特异凝集素。
方法：每0.5 ml的血清中加入0.025 ml的鸡红细胞，轻摇后静置至少30 min，800 g离心2～5 min，收集上清液，即为处理后的血清，或者也可用被检禽种的红细胞。
2 器材的选择和使用为使器材保持最佳工作状态，应建立选择、使用、维护器材的标准操作程序，所用器材主要有单道、多道可调微量加样器、微量反应板、吸头等，微量反应板、吸头尽量使用一次性产品。
禽流感血凝抑制试验
禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与阴、阳性血清使用说明书【主要成分与含量】抗原为灭活的H5亚型禽流感病毒，血凝效价≥7log2。
阳性血清为SPF鸡感染禽流感病H5亚型制备的高免血清，HI效价≥7log2。
阴性血清为SPF鸡血清。
【性状】抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。
易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
【作用与用途】用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型抗体。
【用法与测定】1、材料1.1 96孔V型（90°）微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。
1.2 PH值7.2 0.01mol/L PBS1.2.1 配制25倍PB 称量2.74 Na2HPO4和0.79gNaH2PO4·H2O,，加蒸馏水至1000m1;1.2.2 配制1倍PBS 量取40m1 25倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸馏水至1000m1;1.2.3 用Na0H或HCL调pH值至7.2;1.2.4 69Kpa15min高压灭菌或用微孔滤膜过滤除菌。
1.2.5 PBS一经使用，于2-8℃保存不超过3周。
1.3 阿氏(Aisevers)液称葡萄糖2.5g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0. O55g、氯化钠0.42g,加蒸馏水至1OOm来ml，加热溶解后调pH值至6.1， 69Kpa 15min 高压灭菌，2-8℃保存备用。
1.4 1%鸡红细胞悬液采集采集2-3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH值7.2 0.Olmol/L PBS液洗涤3次，每次均以3000rpm/mi n离心5min，洗涤后用PBS配成1% (V/V)红细胞悬液，2-8℃保存备用。
（采5ml鸡血，分置3管，添加盐水6ml，多一点也没关系，充分用吸管反复吹打混均，放置在离心机离心，把上清液去掉，反复3次。
）1.5 抗原溶解冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量，用PBS溶解。
禽流感血凝和血凝抑制试验的质量控制
在 血 清样 品 抗 体 检 测 过 程 中 ，经 常 出现 胶 冻 样 血 清 ，或
完 全 凝 结 ，直 接 不 能 进 行 检 测 。鸡 血 清 析 出 呈 胶 冻 样 的 可
先 做 血 凝 试 验 ，抗 原 使 红 细 胞 完 全 凝 集 的稀 释 度作 为 血 凝 效 价 ，注 意 要 做 ３个 重 复 ，根 据 ３次 检 测 结 果 来 确定 血 凝
３ 试 验 操 作
成 根 据 防疫 员 分 离 血 清 的 情 况 ，饲 喂 高 水 平 蛋 白质 饲料 鸡
分离的ｍ清多呈现胶冻状。
２ 试 剂 配 制
２ ． １ １ ％鸡 红 细 胞 悬 液 的 配 制
试 验 前 按 高 致 病 性 禽 流 感 诊 断 技 术 国 家 标 准 要 求 配 制 好 等 渗 磷 酸缓 冲液 （ Ｐ Ｂ Ｓ ） ，调 整 其 ｐ Ｈ值在 ７ ． ０ ～ ７ ． ２范 围 内 ，经 高 压 处 理 后 备 用 。若 稀 释 液 偏 酸 性 ，易 使 红 细 胞 溶 解 ；偏 碱 性 ，则 使 吸 附 于 红 细 胞 上 的病 毒 易 脱 落 ，不 利 于 观 察 。 均影 响实 验结果 的判定 ［ ５ １ 。Ｐ Ｂ Ｓ配 制 时 间 过 长 ，ｐ Ｈ 值 会 发 生 变
鸡 的 脂 肪 堆 积 过 多 ，在 血 清 巾的 蛋 白纤 维 和 脂 肪 析 出 过 多 而
个 单 位 抗 原 的 配制 准确 无 误 ，应 做 回归 试 验 ，同 归 试 验 成 立
表 明 该 ４单 位 抗 原 配 制 准 确 ，可 用 于 血 凝 抑 制 试 验 。 否 则 ， 需 重 新 测 定 抗 原 效 价 ，重 新 配 制 。４个 血 凝 单 位 抗 原 需 现 配 现用 。 时 间 过 长 ，病 毒 的 凝 集 力 降低 ，不 放 低 温 保 存 ，病 毒 的凝 集 力 会 很 快 下 降 。影 响试 验结 果 ［ ６ １ 。
血凝抑制实验_实验报告
一、实验目的1. 了解血凝抑制实验的基本原理和操作方法。
2. 掌握血凝抑制实验在禽流感病毒检测中的应用。
3. 学会通过血凝抑制实验结果判断禽流感病毒的感染情况。
二、实验原理血凝抑制实验（Hemagglutination Inhibition Test，HIT）是一种检测病毒感染的方法，通过检测血清中病毒特异性抗体的存在和效价，来判断动物是否感染过某种病毒。
在禽流感病毒检测中，该实验主要用于检测血清中的禽流感病毒抗体水平，从而判断禽流感病毒感染状态。
实验原理：当禽流感病毒与含有抗体的血清混合后，病毒表面的血凝素（HA）与抗体结合，导致病毒颗粒聚集，血凝素活性降低，从而使红细胞不发生凝集。
通过观察红细胞是否发生凝集，可以判断血清中是否含有禽流感病毒抗体。
三、实验材料1. 禽流感病毒抗原2. 1%鸡红细胞悬液3. 0.5%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）4. PBS缓冲液5. 96孔V型酶标板6. 微量移液器7. 振荡器8. 恒温培养箱9. 移液器吸头四、实验方法1. 准备工作（1）将禽流感病毒抗原用PBS缓冲液稀释至适当浓度。
（2）将鸡红细胞悬液用PBS缓冲液稀释至1%。
（3）将PVP用PBS缓冲液溶解，浓度为0.5%。
2. 血凝抑制实验（1）取96孔V型酶标板，每孔加入25μL PBS缓冲液。
（2）在第一排第1孔中加入25μL禽流感病毒抗原，混匀后，从第1孔吸取25μL加入第2孔，依次进行倍比稀释至第24孔，最后弃去25μL。
（3）向每孔加入25μL 1%鸡红细胞悬液，混匀后置于振荡器上振荡10秒。
（4）将酶标板置于室温（20-25℃）下静置30分钟。
（5）观察红细胞是否发生凝集，记录结果。
3. 结果判定（1）完全抑制：红细胞不发生凝集。
（2）部分抑制：红细胞发生凝集，但凝集程度较轻。
（3）未抑制：红细胞发生凝集，凝集程度明显。
五、实验结果与分析1. 结果记录根据实验结果，记录每孔红细胞凝集情况，并计算抑制率。
影响禽流感血凝及血凝抑制试验结果的因素及操作规范
2021年3月第38卷第3期影响禽流感血凝及血凝抑制试验结果的因素及操作规范高爱萍，刘胜宇（江苏省徐州市畜牧兽医站，江苏徐州221000）禽流感病毒、鸡新城疫病毒均能凝集鸡的红细胞，这种红细胞凝集现象可以被特异性免疫血清抑制，可用于检测禽注射疫苗后抗体应答水平及证实是否曾感染，广泛应用于禽流感等重大动物疫病防控中。
HA-HI 试验经济、方便，结果可靠，作为WHO 采用的全球禽流感监测方法，也被纳入我国高致病性禽流感诊断技术的国家标准。
在实际操作中，多种因素均会影响血凝抑制试验结果，从而导致试验结果不准确。
笔者长期从事实验室检测工作，参考行业相关资料，现将影响HA-HI 试验结果的因素作一分析。
一样品因素正确采集被检禽的新鲜血液，及时分离血清，避免溶血及腐败变质（有些样品凝固后呈胶冻样，影响检测结果，应避免喂食后立即采集），并做好样品标记及采样记录。
血清分离后及时检测或放置在4°C 冰箱保存。
若暂不检测，可冷冻保存（-20°C 以下），血清测定前须恢复至室温，并充分摇匀。
二1%红细胞因素配制1%的红细胞，最好采集至少3只SPF 公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康鸡的血液。
最好采集成年公鸡的血液制作红细胞供体，太小的鸡红细胞稳定性差，会影响检测结果。
在HA-HI 试验过程中，有时用鸡红细胞检测鸭或鹅等血清样品时会出现非特异性凝集现象，因此，在试验过程中尽量选择与检测样品相同来源的非免疫禽的红细胞。
采集好的血液与等体积的阿氏液混合，或加入3.8%柠檬酸钠，肝素作为血液抗凝剂可能对红细胞凝集反应有影响。
采集好的血液尽快送至实验室，用pH 7.20.01mol/L PBS 洗涤3次，每次以1000r/min 离心10分钟后倒掉上清液，尽可能吸去红细胞表层的白细胞，然后再加入20~30体积的pH 7.20.01mol/L PBS ，重新悬浮红细胞。
洗涤后用PBS 配成体积分数为1%的红细胞备用。
禽流感血凝抑制试验的影响因素分析
液 配 制 时 间过 长 、确 。 如 果 用 灭 菌 生 理 盐
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资源 育繁
鸡 的人 工 授精技 术要点
付 友 山 （ 宁省农 业经 济 学校 １ １ ０ ） 辽 ２ ０ １
与 自然 交 配 相 比 ， 鸡 的 人 工 授 精 技 术 具 有 明 显 的优 点 。 人 丁 授 精 能 充 将 选择 好 的种 公 鸡在 采 精前 １２ ～ 周 应 单 笼 饲 养 。 在 采 精 前 ｌ周 左 右 开 始 采 精 训 练 。每 天 ｌ ２次 ．经 过 ３ ４ ～ ～ｄ
凝 抑 制 因 子 ，尤 其 是 水 禽 ， 因 此 在 样
品 进 行 血 凝 抑 制 试 验 前 ． 应 先 除 去 非
特 异 性 凝 集 因 子 。通 常 使 用 受 体 裂 解
酶 （Ｅ Ｒ Ｏ） 或 高 碘 酸 钠 法 对 水 禽 血 清
洗 ３ ５次 ，甩 净 蒸 馏 水 放 入 ３ ℃温 箱 ７ 烘 干 备 用 。 如 使 用 一 次 性 凝 集 板 ，要
禽流感血凝抑制试验
要求 按 照适 时 采 样 、合 理 采 样 、
典 型 采 样 、无 菌 采 样 、适 量 采 样 、 安
（）１ ３ ％红 细 胞 悬 液 制 备 。鸡 翅 静
脉或 心脏 采 血 （ 意最 好 选 择 ３只 Ｓ Ｆ 注 Ｐ
或 未 免 疫 成 年 公 鸡 ） 放 入 灭 菌 试 管 。
的 饲 养 数 量 ，降 低 生 产 成 本 ；可 以 克
服 公 母 鸡 的 个 体 体 重 差 异 、 品 种 问 差 异 及 笼 养 种 母 鸡 自然 交 配 困 难 ， 提 高
禽流感血凝和血凝抑制试验
禽流感血凝和血凝抑制试验禽流感血凝-血凝抑制试验操作方法及注意事项禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。
该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。
但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。
一、血凝试验操作程序1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。
2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。
3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。
第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。
以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）二、血凝抑制试验操作程序1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。
（即1HAU抗原除以4）2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。
3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。
4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。
5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。
高致病性禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验可打印
高致病性禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验一、材料准备1、96孔90℃V型微量反应板，微量移液器（配有滴头）。
2、阿氏（Alsevers）液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录。
3、PH7.2、0.01mol/L PBS.4、高致病性禽流感病毒血凝素抗原和阳性血清以及阴性血清。
二、操作方法1、血凝（HA）试验（微量法）1.1在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025ml PBS,换滴头。
1.2吸取0.025ml病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第1孔，混匀。
1.3从第1孔吸取0.025ml病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃之，换滴头。
1.4每孔加入0.025ml PBS。
1.5每孔加入0.025ml体积分数为1％的鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）见附录。
1.6振荡混匀，在室温（20℃～25℃）下静置40min后观察结果（如环境温度太高，可置4℃环境下）。
对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。
1.7结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。
完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU)。
2、血凝抑制（HI）试验（微量法）2.1根据1试验结果配制4HAU的病毒抗原。
以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。
例如，如果血凝的终点滴度为1：256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64（256除以4）。
2.2在微量反应板的1孔～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。
2.3吸取0.025ml血清加入第1孔，充分混匀后吸取0.025ml加入第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。
2.41孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025ml，室温（约20℃）静置至少30min。
2.5每孔加入0.025ml体积分数为1％的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高，可置4℃条件下进行，对照孔红细胞将呈明显钮扣状沉于孔底。
血凝抑制实验报告
一、实验背景血凝抑制实验是一种检测血清中抗体水平的常用方法，主要用于监测禽流感等病毒感染。
该实验通过检测血清中抗体的存在和活性，可以判断个体是否感染过某种病毒，以及疫苗免疫的效果。
本实验旨在通过血凝抑制实验，监测禽流感病毒感染情况，评估疫苗免疫效果。
二、实验目的1. 掌握血凝抑制实验的基本原理和操作方法；2. 检测禽流感病毒感染情况；3. 评估疫苗免疫效果。
三、实验原理血凝抑制实验是利用病毒对红细胞表面的受体进行吸附，导致红细胞发生凝集的现象。
当血清中存在抗体时，抗体与病毒结合，阻止病毒与红细胞受体的结合，从而抑制血凝现象的发生。
通过观察血凝现象的变化，可以判断血清中抗体的存在和活性。
四、实验材料1. 禽流感病毒抗原；2. 鸡红细胞；3. 血清；4. PBS缓冲液；5. 微量移液器；6. 酶标板；7. 振荡器；8. 酶标仪；9. 实验室温度计。
五、实验方法1. 准备工作：将禽流感病毒抗原、鸡红细胞、血清、PBS缓冲液等实验材料准备齐全，并置于室温下平衡。
2. 血凝抑制实验操作：（1）取96孔90V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25μL PBS液。
（2）吸取25μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中，充分混匀。
（3）从第1孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25μL。
第三排孔至第四排孔同上操作。
（4）依次向第一至第五排孔的每孔中加入25μL 1%的鸡红细胞悬液。
（5）将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30分钟，观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
（6）将酶标板放入酶标仪，设置波长为540nm，读取各孔的吸光度值。
六、实验结果与分析1. 结果判定：（1）以血清最高稀释度抑制50%红细胞凝集的抗体滴度（ID50）为血清抗体水平。
（2）ID50越高，说明血清中抗体水平越高，病毒感染情况越严重。
标准操作规程(SOP)——红细胞凝集抑制试验鉴定流感禽流感病毒方法
本SOP 是为了规范红细胞凝集抑制试验（HI ，hemagglutination inhibition test ）的操作规程，确保试验质量而制定。
二、范围适用于中国国家流感中心所有技术人员进行红细胞凝集抑制试验，鉴定流感/禽流感病毒。
三、程序（一）生物安全要求季节性流感病毒及经完全灭活的高致病禽流感病毒和H2N2流感病毒操作可以在BSL-2实验室里进行，操作人员采取BSL-2级防护。
禽流感H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行，操作人员采取BSL-3级防护。
具体防护参见“流感中心生物安全个人防护SOP ”。
（二）材料1．流感病毒参比抗原及参比抗血清2．待检病毒3．1%红细胞悬液（鸡、豚鼠红细胞，由于“O ”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞）4．磷酸缓冲液（PBS ），0.01M ，pH 7.4 (Sigma P 3813)5．多道及单道可调加样器单通道可调加样器量程为 20μL ～200μL 、200μL ～1000μL8通道或12道可调加样器量程为 20μL ～200μL6．96孔微量板：鸡红细胞选择“V ”型或“U ”型底微量板；豚鼠红细胞选一、目的标准操作规程（SOP ）——试验鉴定流感/择“U”型底微量板。
7．其它耗材，200μL、1000μL滴头、试管、加样槽等。
（三）实验步骤1．试验前准备（1）PBS配制：按照Sigma的说明书的要求配制PBS缓冲液。
121℃高压灭菌20min，分装，4℃储存。
（2）1%红细胞悬液：按照“1%鸡红细胞悬液配制SOP、1%豚鼠红细胞悬液配制SOP”配制红细胞悬液。
（3）制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原1）一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。
进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个红细胞凝集单位（指25μL体积中含有4个红细胞凝集单位）的病毒量。
禽流感HN血凝和血凝抑制试验培训课件(一)
禽流感HN血凝和血凝抑制试验培训课件(一)
禽流感是一种由禽类传播的病毒性疾病，它严重影响禽类养殖业的稳定和人们的健康。
为了加强对禽流感的诊断和监测，现已开展了许多相关培训课件，其中包括HN血凝和血凝抑制试验培训课件。
一、 HN血凝试验
HN血凝试验是一种有效检测禽流感的方法。
该试验涉及到鸭或鸡的腹腔内的红白血球，以及指定的病毒抗原和抗体。
该试验的转化需要将抗原和抗体分别注入鸡和鸭体内，然后观察细胞凝集的形成情况，最终确定结果。
二、血凝抑制试验
血凝抑制试验是检测禽流感的另一种方法。
这种试验依赖于血红蛋白联合病毒和抗体。
在正常情况下，抗体能够识别并抑制病毒，防止病毒感染红血球。
但是，当感染病毒时，一些抗体会被该病毒绑定，使掉血集合的凝固作用被阻止，从而导致血小板和红细胞受到影响。
三、培训课件的优点
1. 它可以提高禽类人员的技能和能力，他们可以通过学习这些课件加强对禽流感的认知。
2. 通过学习HN血凝和血凝抑制试验的原理和流程，人们能够更好地理解各种试验的工作原理，包括试验的优缺点和最佳实践。
3. 通过掌握这些试验技巧，专业人员将可以更高效地诊断出禽流感。
四、总结
HN血凝和血凝抑制试验是两种有效的禽流感检测方法。
培训课件可使
禽类专业人员更好地掌握这些技巧，并提高他们处理这类病毒的能力。
最终，这些技能和知识将有助于确保禽类养殖业的稳定和人类的健康。
禽流感血凝抑制试验体会
2020年第4期 吉林畜牧兽医67·经验交流·JingYan JiaoLiu禽流感血凝抑制试验体会白 翠1，李海燕2，郑 聪3，刁鹏翔4，王 晋11.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062；2.吉林省通化市二道江区畜牧兽医总站，吉林通化 134000；3.吉林市龙潭区江北乡畜牧兽医站，吉林吉林市 132000；4.吉林市昌邑区两家子乡畜牧兽医站，吉林吉林市 132000禽流感血凝和血凝抑制试验是禽流感抗体检测常用的实验。
免疫抗体的监测工作对禽流感的防控工作有重要的意义。
1 血凝和血凝抑制的定义血凝是某种病毒能够使某种动物的红细胞发生凝集的现象。
它在血凝抑制试验中，用于4单位抗原的测定和抗原回归试验。
血凝抑制是当病毒悬液中加入了特异性的抗体，这种抗体的量完全能够抑制病毒凝集红细胞的现象。
2 试验前各种试剂的准备2.1 阿氏液和PBS 2.1.1 阿氏液阿氏液最好是现用现配，也可以提前配好高压灭菌后备用。
2.1.2 PBSPBS 可以按照试剂说明书或者实验室存放的指导手册自行配置，并进行pH 的测量。
为了方便实用，操作准确，市场上也有成品的液体，还有配制好的粉末（只需按照说明溶于蒸馏水中即可）。
这两种都建议使用，省去我们各种配置环节。
对于成本而言，粉末状的更便宜些，适合大量操作样品的实验室使用。
2.2 1%红细胞为防止溶血和不同个体鸡只对HI 效价的影响，一般采取3只或3只以上的SPF 公鸡，采血后不可随意上下左右摇晃采血管，分离后的血清冷藏保存，一般不要超过24 h。
洗涤红细胞过程中，要用PBS 缓慢吹吸，力度均匀，不可用力过猛。
离心的转数不超过2 000 r/min，转数过高会引起溶血现象。
有部分文献表明，洗涤液PBS 要好于生理盐水，因为PBS 有对其它酸碱物质缓冲的能力，可以维持反应体系的pH 值，而生理盐水不具备这种缓冲的作用。
还有的操作人员，误把纯净水当成洗涤液，造成不必要的结果，所以我们在洗涤前要做好各种试剂的准备工作。
禽流感抗体水平测定实验原理
禽流感抗体水平测定实验原理禽流感抗体水平测定实验原理其实还挺有趣的呢。
咱就把它想象成一场身体里的小战争，抗体就像是士兵一样。
咱们先说说禽流感病毒，这是一种很狡猾的家伙。
当它入侵动物或者人的身体后，身体的免疫系统就会被激活。
就好像身体里有个警报器响了，然后免疫系统就开始制造抗体来对抗禽流感病毒。
这个时候呢，我们要测定抗体水平。
怎么测呢？就像是要数一下有多少士兵在对抗敌人一样。
有一种方法是通过血清学检测。
血清就像是一个信息库，里面有很多关于身体免疫系统反应的信息。
具体来说，有血凝抑制试验这个方法。
这个试验的原理是基于禽流感病毒表面有血凝素，它可以让红细胞凝集起来。
但是如果有抗体存在，抗体就会和血凝素结合，这样就阻止了红细胞的凝集。
我们就可以根据红细胞凝集被抑制的程度来判断抗体水平的高低。
还有一种方法是酶联免疫吸附试验（ELISA）。
这个试验的原理有点像搭积木。
在一个特制的板子上，先固定好禽流感病毒的抗原，然后加入含有抗体的血清样本。
如果样本里有抗体，抗体就会和抗原结合。
接着再加入一种酶标记的二抗，这个二抗可以识别一抗（也就是和抗原结合的抗体），最后加入底物，酶就会作用于底物产生颜色变化。
颜色的深浅就和抗体的含量有关啦，颜色越深，说明抗体水平越高。
再说说间接免疫荧光试验。
这个试验是利用荧光标记的二抗来检测抗体。
先把细胞或者组织样本固定在载玻片上，然后加入一抗（也就是我们要检测的针对禽流感病毒的抗体），如果样本里有抗体，抗体就会和样本里的抗原结合。
接着加入荧光标记的二抗，在荧光显微镜下，我们就能看到发出荧光的地方，从而判断抗体的存在和水平。
这些实验原理都是为了更好地了解动物或者人在感染禽流感病毒后，身体里的抗体情况，这样就能帮助我们研究禽流感的流行情况，预防禽流感的传播，也能为疫苗的研发和效果评估提供重要的依据呢。
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标准操作规程（SOP ）
中国国家流感中心
流感/禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测
一、目的 该文件是为流感/禽流感抗体检测、鉴定的血清学试验制定，用以说明红细胞凝集抑制试验用于血清抗体检测的操作过程和规范，确保红细胞凝集抑制试验的操作过程符合规范，确保抗体检测结果可信、滴度准确。
二、范围
适用于中国国家流感中心所有技术人员进行流感/禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测。
三、程序
（一）生物安全要求
H5、H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。
（二）材料
1．抗原：
季节性流感病毒：人群中常见流行的流感病毒如A （H1N1）、A （H3N2）、B 型流感病毒的标准参照抗原；抗原制备需要在BSL-2实验室进行，操作人员穿工作服、工作鞋，戴手套、帽子、口罩。
抗原制备、灭活见《流感/禽流感灭活抗原的制备和纯化SOP 》 和《β-丙内酯病毒灭活SOP 》。
禽流感病毒：灭活的H5N1亚型流感病毒。
抗原制备需要在BSL-3实验室进行，操作人员穿双层工作服、戴双层手套、帽子、口罩、防护目镜以及工作鞋。
抗原制备、灭活见《流感/禽流感灭活抗原的制备和纯化SOP 》 和《β-丙内酯病毒灭活SOP 》、《多聚甲醛病毒灭活SOP 》，灭活后的抗原可在BSL-2实验室内操作。
2．血清：
（1）季节性流感参比血清： 编号：CNICSOP07034 制定时间：2007.01 制定人：王敏 梁倩 审核人：白天 董丽波 批准人：舒 跃 龙 生效日期：2007.03 版本号：V-2
A（H1N1）亚型标准抗血清
A（H3N2）亚型标准抗血清
B型Yamagata系标准抗血清
B型Victoria系标准抗血清
血清取用需要在BSL-2实验室生物安全柜内进行。
（2）季节性流感待检血清：需急性期和恢复期双份血清，血清取用需要在BSL-2实验室生物安全柜内进行，相关操作见《临床标本的接收和保存
SOP》。
（3）禽流感参比血清：由H5N1毒株制备的鸡血清，相关操作见《流感/禽流感鸡血清制备SOP》。
（4）疑似禽流感病例待检血清：需急性期和恢复期双份血清，血清取出需要在BSL-3实验室生物安全柜内进行，相关操作见《临床标本的接收和
保存SOP》。
3．其他试剂：
（1）红细胞悬液：常用鸡、豚鼠、马红细胞悬液。
红细胞悬液制备按照相关红细胞制备SOP进行。
（2）磷酸缓冲液（PBS），0.01M，pH 7. 2
将1包PBS粉剂（Sigma）溶于1000mL去离子水中。
121℃高压灭菌，至4℃保存，保存期为3周。
（3）生理盐水：0.85% NaCl
4．其他：
96孔微量板：“U”型底微量板、”V”型底微量板（Corning）
37℃水浴锅
56℃水浴锅
台式离心机
多道可调加样器
离心管
（三）实验步骤
1．按《血清处理SOP》处理血清。
2．按下表所列条件选择红细胞凝集板和实验条件。
流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较
红细胞鸡豚鼠马
流感病毒禽流感病毒适用范围流感和禽流
感病毒
终浓度（％）0.5 0. 5 0.5
孔底部形状U或V型U型U型
孵育时间30min 60min 60min
细胞对照细胞沉积成
细胞沉积成环状细胞沉积成环状
圆点状，倾斜
时细胞向下
流成泪滴状，
注：由于“O”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞。
3．红细胞凝集试验（HA）检测参比抗原滴度，具体操作见《流感/禽流感病毒红细胞凝集抑制试验鉴定SOP》。
4．制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原，具体操作见《流感/禽流感病毒红细胞凝集抑制试验鉴定SOP》。
5．红细胞凝集抑制试验（HI）检测血清抗体
（1）流感鉴定常用的4种参比抗原：
1）A（H1N1）亚型代表毒株参比抗原
2）A（H3N2）亚型代表毒株参比抗原
3）B型Yamagata系代表毒株参比抗原
4）B型Victoria系代表毒株参比抗原
禽流感鉴定抗原：采用国家流感中心提供的参比抗原。
（2）流感血清抗体鉴定：
根据所用红细胞选用适当的微量板，须设立血清对照板。
将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方
向称行，如A1～A12称为A行。
标记好待检病毒的实验室编号及加样
顺序。
1）除A行外，每孔加入25μL PBS缓冲液。
2）按以下顺序，在A行各孔加入处理过的血清50μL。
A1：待检血清标本1，急性期血清
A2：待检血清标本1，恢复期血清
A3：待检血清标本2，急性期血清
A4：待检血清标本2，恢复期血清
A5：待检血清标本3，急性期血清
A6：待检血清标本3，恢复期血清
A7：待检血清标本4，急性期血清
A8：待检血清标本4，恢复期血清
A9：A（H1N1）亚型标准抗血清
A10：A（H3N2）亚型标准抗血清
A11：B型Yamagata系标准抗血清
A12：B型Victoria系标准抗血清
3）用多道加样器从A行各孔分别吸取25μL血清，由A行至H行进行2倍稀释血清，弃去H行最后25μL液体。
4）红细胞凝集抑制试验板每孔加入25μL新配制的4个凝集单位的抗原。
5）血清对照板每孔加入25μLPBS。
6）轻轻弹击微量板，使抗原与抗体充分混合。
7）室温孵育20min。
8）每孔加入50μL红细胞悬液，混匀。
9）室温孵育，时间参照上表。
10）观察红细胞凝集抑制试验结果，对照板应不出现凝集。
（3）禽流感血清抗体鉴定：
1）每孔各加25μL PBS。
2）A1加入标准诊断血清作为阳性对照；A2加入H5N1阴性血清作为阴性对照。
3）若未知血清来源省份为已有禽流感病例、并分离到禽流感病毒的省份，用该省的抗原作为鉴定未知血清的检测抗原，自A3开始分别加入不同待检血清25μL；若未知血清来源省份为其它省份，则使用人禽流感代表株作为检测抗原，自A3开始每三孔加入同样待检血清，各25μL。
采用急性期和恢复期血清作对照。
4）用多道加样器从A行分别取25μL血清，由A行至H行做2倍系列稀释血清，弃去H行25μL。
5）A1、A2列加入代表株抗原25μL，A3列开始加入待检血清对应的检测抗原25μL（4个凝集单位的抗原）。
6）混匀，置室温孵育，时间见上表。
7）每孔加入50μL鸡红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。
8）室温孵育30min，观察红细胞凝集抑制试验结果。
当特定的抗体与相应的红细胞凝集抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象。
红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。
如1:80稀释的血清孔不出现凝集（红细胞凝集完全抑制），1:160稀释的血清孔出现凝集（无红细胞凝集抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。
流感结果判定标准：
①待检血清对参比抗原的抑制效价≥40才认为有保护作用。
②恢复期血清抗体效价比急性期血清4倍以上增高才可认为有保护作用。
禽流感结果判定标准：
①待检血清对参比抗原的抑制效价≥1:80才可以算为阳性。
②恢复期血清抗体效价比急性期血清4倍以上增高才可算阳性。
（4）红细胞凝集抑制试验注意事项
1）红细胞凝集抑制试验必须用4个红细胞凝集单位/25μL的抗原，抗原必须新鲜配制。
2）红细胞悬液的配制必须标准化。
3）正确存放试剂，避免反复冻融及污染。
4）冻干的试剂应按照说明溶解，保存。
5）鉴定待检血清的红细胞凝集抑制试验要设定以下对照：红细胞对照、阴性对照血清，以防其它非特异性抗体的影响；参比血清对照，防止非特异性凝集素及抑制素的干扰。
6）实验中所有用过的滴头均需在0.2%次氯酸钠溶液中浸泡过夜后丢弃到封口袋内，再行高压处理；红细胞凝集板使用后用封口袋封好，丢入生物废弃袋内高压处理。
剩余的血清在4℃冰箱保存。