土霉素作业

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绪论：.................................. 错误！未定义书签。

1 产品简介........................................... - 3 -
1.1、土霉素的简介................................. - 3 -
1.2 土霉素生产工艺流程............................ - 4 -
2 设备型号........................................... - 4 -
3 实验过程........................................... -
4 -
3. 1斜面孢子的制备：.............................. - 4 -
3.2 种子培养基的制备与灭菌：...................... - 5 -
3.3 发酵培养基的配制与灭菌：...................... - 6 -
3.4 发酵：........................................ - 6 -
3.5 测定前发酵样品预处理：........................ - 6 -
3.6 土霉素酸化液的发酵提取：...................... - 7 -
3.7 122#树脂预处理方法：........................... - 7 -
3.8 结晶、干燥及效价的测定：...................... - 8 -
4 后续处理........................................... - 8 -
5 小组讨论........................................... - 8 -
6 实验数据........................................... - 8 -
6.1 OD值的测量................................... - 9 -
6.2 绘制图像..................................... - 9 -
7 参考文献........................................... - 9 -
土霉素生产工艺流程
本次设计主要涉及到土霉素发酵生产的具体工艺流程，分为三级发酵、过滤、脱色、结晶、干燥等。

物料衡算主要包括培养基各组分含量及日常生产所耗物料量，能量衡算主要包括发酵热，水，蒸汽及无菌空气的消耗量计算。

设计主要是以种子扩大培养和发酵两个阶段为主。

目前，全世界的医药产品生产已有一半以上由生物技术合成，其中，抗生素、维生素、激素这三大类药物主要由微生物发酵生产。

抗生素在世界范围内的应用十分广泛，从而有效地控制了许多传染疾病，同时也促进了发酵工业的发展。

土霉素为四环类抗生素，生产工艺简单、生产成本较低，可作为生产其它新型抗生素的原料。

土霉素价格低廉，可以作为饲料添加剂用于养殖业。

实践表明：土霉素用于饲料添加剂，可以改善饲料转化效率，促进畜禽生长，提高畜禽抗疾病能力。

土霉素对多数革兰氏阳性菌(如肺炎球菌，溶血性链球菌，草绿色链球菌以及部分葡萄糖球菌，炭疽杆菌)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌，产气杆菌，破伤风，肺炎杆菌，流感杆菌，百日咳杆菌等)均有抗菌作用。

临床上主要用于肺炎、败血症、斑疹、伤寒、淋巴肉芽肿、沙眼及其他细菌性感染等。

对伤寒有效，也可用于阿米巴痢疾和阴道滴虫病患者。

此外还能抑制立克次体和沙眼病毒及淋巴肉芽肿病毒。

作为抗生素，上世纪六七十年代时，土霉素曾在抗菌药市场上占重要地位，但伴随着其它多种高效抗生素的诞生与发展，土霉素市场快速走向衰落。

目前，土霉素已经极少用于临床了。

此次我们主要针对土霉素的详细过程进行实验室生产，以了解土霉素的工艺流程。

根据分批培养发酵的原理，对龟裂链丝菌进行培养，再进行一次的种子扩培之后，把菌种以也溶液的形式加入刚灭完菌的发酵罐，同时加入必要的成分进行发酵，每隔24小时测一次龟裂链霉菌的菌丝浓度，采用721分光光度计在620nm下测发酵液OD值，期间，观察并记录发酵过程中菌种的生长变化，一周之后在菌丝接近自溶前放罐，得到土霉素发酵液。

1 产品简介
1.1、土霉素的简介
土霉素(Terramycin)又称地霉素、氧四环素(Oxytetracycline)，化学名：(4s,4аR,5S,5аR,6S,12аS)-N-4-二甲胺基-1,4,4а,5,5а,6,11,12а-八氢,5, 6,10,12,12а-六羟基-6-甲基-1,11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，是四环素类抗生素的一种，因结构上含有四并苯基的母核而得名，本品为灰白色至黄色的结晶粉末，无臭，味苦，熔点是180℃，在空气中性质稳定，在日光下颜色变暗在碱性溶液中易破坏失效。

土霉素的盐酸盐为黄色结晶，味苦，熔点190～194℃，有吸湿性，但水分和光线不影响其效价，在室温下长期保存不变质，不失效。

盐酸盐易溶于水，溶于甲醇，微溶于无水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性条件下不稳定。

添加到饲料中，在室温下保存四个月，效价下降4%～9%，制粒时效价下降5%～7%。

其结构和命名如图。

土霉素是典型的次级代谢产物，其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、产物期和菌体期三个阶段。

龟裂链丝菌的生长和土霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响：温度、发酵P H 值、溶氧、接种量、泡沫等。

同时还受
到一些代谢调控机制的控制，磷酸盐的的调节作用、ATP 的调节和产生菌生长速率的调节等。

本品为广谱抑菌剂，能特异性地与细菌核糖体30S 亚基的A 位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成，能抑制动物肠道内的有害微生物，激活大肠中有利于营养物质合成的微生物。

可使动物肠壁变薄，更有利于营养物质的吸收和利用，从而提高肠道吸收效率。

许多立克次体属、支原体属、衣原体属、螺旋体、阿米巴原虫和某些疟原虫也对本品敏感。

肠球菌属对其耐药。

其他如放线菌属、炭疽杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、梭状芽孢杆菌、奴卡菌属、弧菌、布鲁菌属、弯曲杆菌、耶尔森菌等对本品敏感。

R 3 N H H O H
O H O O H O R 2 O H N H R 5
O C H 3 C H 3 R 4 R 1
1.2 土霉素生产工艺流程
菌种的培养→种子培养→发酵→酸化提取→脱色结晶干燥→得到土霉素成品，并
测定效价。

2 设备型号
设备名称编号及型号（产地）
空气恒温振荡器HZQ-C 型
电子天平型号-MP2002
分管光度计上海精密科学仪器有限公司
发酵罐编号：20051829 ；单位：0303 BICF-2002型空气压缩机储气罐型号：CW120C 编号 F0407303 台州市
静音式全无忧空压机鞍山佳朋压缩机有限公司
离心机LG10-2.4A 北京医用离心机厂
树脂柱上海亚荣生化仪器厂
电热复空干燥箱编号：20041041 型号：2K-82BB型单位：上
海实验仪器有限公司
自动压力蒸汽灭菌机型号：GI54DW
磁力搅拌器型号：JB-1
3 实验过程
3. 1斜面孢子的制备：
无菌条件下，从冷藏的龟裂链霉菌的斜面孢子中，刮取适量孢子涂在PDA（马
铃薯琼脂培养基）斜面上，然后置30℃的恒温培养3天。

我们采用马铃薯葡萄糖琼脂（PAD）培养基制作固体试管斜面，它是一种常
用培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小
时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试验，每试管约5-10ml（视试管大小而定）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基配方表
成分含量
马铃薯水葡萄糖琼脂
200g 1000ml 10-20g 17-20g
PDA培养基的灭菌条件：在高压蒸汽灭菌锅内保持121℃,0.14MPa下，20分钟即可。

种子斜面：
无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中刮取适量孢子涂在试管斜面上，然后置28-30℃的恒温箱培养3天。

传代两次，每次接种前挑选长势较好的孢子进行后面的接种，就可以得到较为强壮、优秀的孢子。

3.2 种子培养基的制备与灭菌：
种子培养基配方表
成分含量
淀粉
黄豆饼粉硫酸铵碳酸钙玉米浆氯化钠磷酸二氢钾
3% 0.3% 0.4% 0.5% 0.4% 0.5% 0.015%
按成分配比配制培养基，并加淀粉酶液化后，（就是在白磁板上滴加稀碘液后在加入一定量的培养基液体，待其不变成紫色，这时液化完全）再加入
3
CaCO,冷却后调pH值7.0—7.2，分装，包装灭菌。

灭菌条件：在高压蒸汽灭菌锅内保持121℃，0.14Mpa下，20分钟即可。

3.3 发酵培养基的配制与灭菌：
发酵培养基配方表
成分配比
淀粉
黄豆饼粉硫酸铵碳酸钙氯化钠玉米浆磷酸二氢钾氯化钴淀粉酶
15%
2%
1.4%
1.4%
0.4%
0.4%
0.01% 10μg/ml 0.1%—0.2%
按发酵培养基成分配比，配制培养基，并加淀粉酶液化后，（在白磁板上滴加稀碘液后在加入一定量的培养基液体，待其不变成紫色，这时液化完全）再加入
3
CaCO，冷却后调pH值7.0—7.2，分装，包装灭菌。

灭菌条件：在高压蒸汽灭菌锅内保持121℃，0.14Mpa下，20分钟即可。

3.4 发酵：
发酵液2.5升装入发酵罐，离座灭菌。

接入电源，将已灭菌的发酵培养基通入无菌空气，调整好发酵罐的各类初始参数：温度为30℃、pH6.5、搅拌100r/min、泡沫和消泡剂（豆油）自动调节等。

12小时后观察是否生长杂菌，再将无水乙醇倒入接种口的环槽内，点燃后，进行无菌接种操作，接种量一般为10%。

通气量为1:0.5～1.0vvm,全程用消泡剂消泡，发酵过程通氨，当接种后发酵pH低于6.5时就可以开始通氨，通氨量的多少参考pH值。

要求73小时前pH在6.3～6.6,72～120小时pH在6.2～6.4,120～140小时pH在6.0～6.2。

土霉素的发酵周期约7天，每隔24小时测一次龟裂链霉菌的菌丝浓度，采用721分光光度计在620nm下测发酵液OD值，同时测定土霉素效价。

在菌丝接近自溶期前放罐，得到土霉素发酵液。

3.5 测定前发酵样品预处理：
发酵瓶摇匀，将少量倒入小烧杯，测pH。

用9mol/L的盐酸溶液酸化pH至
1.7～
2.0搅拌10分钟，取5ml酸化液至7ml离心管，6000转离心4分钟，取上清液，备测。

3.6 土霉素酸化液的发酵提取：
（1）、原理：
土霉素在发酵过程中，所产生的土霉素积聚在菌丝中的浓度并不高。

因此，对于土霉素发酵液进行处理的主要目的就是让土霉素从菌丝中释放出来，有利于发酵液中，有利于从发酵液中提取土霉素，更能提高土霉素的收率和质量。

土霉素发酵液中预处理首先要进行的操作是酸化，一般用草酸进行酸化。

加入草酸的目的是释放菌丝中的土霉素，同时要保证土霉素的稳定性、成品的质量和提炼成本。

另外，草酸属于弱酸，其对设备的腐蚀性要比盐酸、硫酸小。

采用草酸不仅能使土霉素释放出来并生成溶于水的盐，并且能析出草酸钙沉淀，从而去除发酵液中的钙离子，同时草酸钙能促进蛋白质的凝结，从而提高滤液的质量。

目前，工业提炼的pH值控制在1.6~2.0范围内，pH值过高对单位的释放不利，pH值过低会影响产品的质量，同时会增加产品的成本。

去杂过程采用的净化剂是黄血盐和硫酸锌，前者有利于提取出铁离子，后者有利于凝固蛋白质。

此外，两者的协同可以产生复盐，对蛋白质有效应除去蛋白质，同时除去铁离子。

（2）、酸化提取方法：
取200ml发酵液，边搅拌，边加入黄血盐、硫酸锌，并加入草酸酸化发酵液，草酸的量通过用酸度计测其pH值来确定，调到所需pH=1.75后，搅拌30分钟。

（黄血盐的加入量约为酸化前发酵液的0.35%）
酸化后要将酸化液进行适当的稀释，一般稀释2-3倍，有利于过滤脱色过程（本实验中两倍）。

本实验中由于酸化液的粘度较大，用简单的过滤方法无法得到效果较好的固液分离，所以采用离心（6000r/min、5min）方法实现固液分离，取其上清夜(129ml)。

3.7 122#树脂预处理方法：
将准备装柱使用的新树脂，先用热水（清洁的自来水即可）反复清洗，阳离子交换树脂可用70-80℃的热水。

开始浸洗时，每隔约15分钟换水一次，浸洗
时不要搅动，换水4-5次后，可隔约30分钟换水一次，总换水7-8次，浸洗至浸洗水不带褐色，泡沫很少时为止。

水洗后，再经酸碱处理，阳离子交换树脂可按下述步骤处理：
（1）、用1N盐酸浸泡树脂，盐酸用量为树脂自身体积的3-5倍，浸泡2-3.5小时。

（2）、用自来水冲洗至出水pH为5左右，用3倍树脂体积5%的Nacl溶液浸泡2小时。

（3）、用1N氢氧化钠浸泡树脂，用量约为树脂本身体积的3-5倍，浸泡2-3.5小时。

（4）、用水冲洗至出水pH为9左右。

（5）、用1N盐酸浸泡树脂，用量约为树脂本身体积的3-5倍，浸泡2-3.5小时，将树脂转成H型。

（6）、用酸浸泡完后用去离子水冲洗至出水pH为6以上即可投入使用。

(7)、对于阴离子交换树脂水洗后的酸碱处理次序，可采用碱-酸-碱的次序。

树脂预处理过程中，用碱浸泡树脂，颜色由本身向橘黄色变为棕黑色，再用酸浸泡，树脂颜色又由棕黑色变为橘黄色。

将处理后的树脂填装入树脂柱，进行酸化液脱色，脱色时流速不能太大，以免造成脱色不充分。

3.8 结晶、干燥及效价的测定：
将一定量脱色液放入烧杯，用碱化剂调pH值到土霉素等电点附近（pH-4.76）。

恒温28℃-30℃用磁力搅拌器搅拌结晶，搅拌转数为70rpm。

将一定量结晶母液倒入培养皿放入ZK-82BB型电热真空干燥箱中进行干燥，干燥后测定干粉的质量，然后将干粉稀释10倍，测定其效价。

4 后续处理
将一定量的结晶母液倒入培养皿放入ZK-82BB型电热真空干燥箱中进行干燥，干燥后测定干粉的质量，然后将干粉稀释10倍，测定其效价。

5 小组讨论
通过这次生产实训使我加深了土霉素生产具体工艺流程和注意事项本次实验
由于人数过多，所以采用团队协调的方法进行实验，这使我们了解到团队合作的重要性同时掌握了高压蒸汽灭菌锅的操作，掌握了接种的步骤及发酵罐过程的控制，掌握了树脂分离的方法，并利用自己的专业知识解决了实验中面临的各种问题，为将来的工作学习打下良好的基础。

6 实验数据
6.1 OD值的测量
组别第一次测量第二次测量第三次测量平均
1 0.744 0.787 0.791 0.774
2 1.572 1.57
3 1.611 1.585
3 1.331 1.368 1.342 1.347
4 1.700 1.717 1.706 1.708
5 1.753 1.765 1.777 1.765
6 1.826 1.839 1.82
7 1.831
7 2.182 2.159 2.213 2.185
6.2 绘制图像
OD值
实验次数
7 参考文献
（1）周德庆微生物学教程北京：高等教育出版社2002
（2）李永利土霉素酸化提取工艺研究内蒙古石油化工 2009年第11期 CNKI （3）田彩霞，赵建强，土霉素结晶工艺改进研究中国抗生素杂志 2006⑶（4）马永林，王晋，梁存珍，杨敏。

土霉素结晶母液酸化水解过程的研究环境科学。