医疗器械无菌检查
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➢ 新鲜配制的培养基，应符合《中国药典》 规定的配方，对培养基进行挑选。
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（5）培养基种类及要求
➢ 硫乙醇酸盐培养基：属于流体培养基， 即在液体培养基中加入0.05%～0.07% 的琼脂，增加了培养基的粘度，降低培 养基中的含氧量，使培养基在一段时间 内保持厌氧的条件，有利于厌氧菌的生 长。硫乙醇酸盐培养基分装在适宜的容 器中，其粉红色的氧化层适合需气菌的 生长，在供试品接种前，培养基的氧化 层的颜色不得超过培养基深度的1／5， 调PH值灭菌后为7.1±0.2，分装，灭菌。
主要内容
n 无菌定义及无菌检查定义 n 无菌检验依据 n 试验主要设备 n 实验环境条件及人员要求 n 培养基种类及配制要求 n 培养基适用性检查 n 试验菌种及菌液制备 n 无菌检查方法验证 n 供试品无菌检查及结果判断
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（1）无菌定义
无菌定义:无活微生物的状态。 无菌检查定义 ： 无菌检查法系用于检查
菌种的要求： 不得超过5代。采用适
宜的方法保存；并以保证试验菌
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（6）培养基适用性检查
菌液制备 ❖ 一般当日使用。 ❖ 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌，少许接种
至营养肉汤基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸 盐流体培养基中，30～35℃培养18 ～24h； ❖ 白色念珠菌的新鲜培养物接种改良马丁培养基中， 23～28℃ 培养24 ～48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌 量小于100cfu/ml菌悬液； ❖ 黑曲霉 菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基 上， 23～28℃培养5 ～ 7天，使大量的孢子成熟。加入3～ 5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液， 将孢子洗脱。然后用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中， 用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制 成小于100cfu/ml 的孢子悬液。（见表）
➢ 硫乙醇酸盐培养管置：30～35℃培养14天。
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（5）培养基种类及要求
❖ 改良马丁培养基：取培养基成分混合，微 温溶解，调节PH值约为6.8，煮沸，摇匀， 调PH值灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。
❖ 改良马丁培养基：置23～28℃培养14天。
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（5）培养基种类及要求
培养基装量： ❖ 对于采用直接接种法检查的液体样品，培
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试验设备（5）--台式蒸汽灭菌器
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试验设备（6）-- 显 微 镜
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试验设备（7）-生物安全柜
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试验设备（8）Equinox 全自动无菌检验系统
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（4）实验环境条件要 求：
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局 部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离 系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操 作，防止微生物污染。单向流空气区、工作 台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区) 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的 现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按 相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度 须符合无菌检查的要求。
药典要求无菌的药品、原料、辅料及其 他品种是否无菌的一种方法。若供试品 符合无菌检查法的规定，仅表明了供试 品在该检验条件下未发现微生物污染。
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（2）无菌检验依据
➢ 本规范选用于《中国药典》2010年版 二部附录XI H无菌检查法。
➢ GB/T 14233.2-2005 《医用输液、输 血、注射器具检验方法 ，第二部分： 生物试验方法中规定的无菌试验方法。
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（3）试验主要设备
➢ 超净工作台 ➢ 细菌培养箱 ➢ 霉菌培养箱 ➢ 立式高压蒸汽灭菌器 ➢ 台式高压蒸汽灭菌器 ➢ 显微镜 ➢ 生物安全柜 ➢ 电热恒温干燥箱 ➢ 集菌仪
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试验仪器（1） - 超净工作台
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试验设备（2）--隔水式恒温培养箱
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试验设备（3）----霉菌培养箱
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试验设备（4）-立式高压蒸汽灭菌器
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（5）培养基种类及要求
保存时间： 制备好的培养基应保存在：2 ℃～25℃、 避光 ❖ 非密闭容器中：一般在三周内使用 ❖ 密闭容器中：一般可在一年内使用
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（5）培养基种类及要求
➢ 一般采用商品脱水培养基，临用时按照 使用说明书进行配制，配制时须迅速， 以免吸潮影响称量的准确性，同时需注 意灭菌后培养基的pH值应符合规定，否 则必须校正后灭菌使用。
养基的装量与供试品装量相关，应根据供 试品接种量确定培养基的装量，使供试品 接种体积不大于培养基的10%。 ❖ 对于采用直接接种法检查的固体样品，培 养基的装量均为100ml；一次性医用材料 及医疗器具，若医疗器具体积过大，培养 基的装量可2000ml以上，已将其完全浸 没为准。 ❖ 对于采用薄膜过滤法检查的样品，封闭式 薄膜滤器的培养基装量为100ml 。
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（6）培养基适用性检查
《中国药典》2010年无菌检查验证试验中使用7株菌见下表
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（6）培养基适用性检查
培养基接种
金黄色葡萄球菌2支 铜绿假单胞菌2支 硫乙醇酸盐流体培养基 枯草芽孢杆菌2支 生孢梭菌2支 9支培养基装量12ml，空白对照1支。
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（6）培养基适用性检查
菌种：试验用菌株及菌液制备： ❖ 金黄色葡萄球菌
[CMCC(B)26003 ❖ 铜绿色假单胞菌
[CMCC(B)10104] ❖ 大肠埃希菌[CMCC(B)44102] ❖ 枯草杆菌[CMCC(B)63501] ❖ 生孢梭菌[CMCC(B)64941] ❖ 白色念珠菌[CMCC(F)98001] ❖ 黑曲霉[CMCC(F)98003]
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百度文库
（4）实验人员要求：
菌检人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术培训。
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（5）培养基种类及要求
❖ 硫乙醇酸盐流体培养基 ❖ 改良马丁培养基
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（5）培养基种类及要求
❖ 无菌检查：硫乙醇酸盐流体培养基
2012年12月
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（5）培养基种类及要求
无菌检查 ：改良马丁培养基：
2012年12月
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（6）培养基适用性检查
❖ 新购的培养基或自配的新鲜培养基要求： ❖ 无菌性检查： ❖ 每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，
应无菌生长。 ❖ 灵敏度检查： ❖ 其质量均应符合灵敏度检查要求。用于培养基灵敏
度检查的菌种如下：菌种的传代的次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代）。
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（5）培养基种类及要求
➢ 硫乙醇酸盐培养基：属于流体培养基， 即在液体培养基中加入0.05%～0.07% 的琼脂，增加了培养基的粘度，降低培 养基中的含氧量，使培养基在一段时间 内保持厌氧的条件，有利于厌氧菌的生 长。硫乙醇酸盐培养基分装在适宜的容 器中，其粉红色的氧化层适合需气菌的 生长，在供试品接种前，培养基的氧化 层的颜色不得超过培养基深度的1／5， 调PH值灭菌后为7.1±0.2，分装，灭菌。
主要内容
n 无菌定义及无菌检查定义 n 无菌检验依据 n 试验主要设备 n 实验环境条件及人员要求 n 培养基种类及配制要求 n 培养基适用性检查 n 试验菌种及菌液制备 n 无菌检查方法验证 n 供试品无菌检查及结果判断
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（1）无菌定义
无菌定义:无活微生物的状态。 无菌检查定义 ： 无菌检查法系用于检查
菌种的要求： 不得超过5代。采用适
宜的方法保存；并以保证试验菌
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（6）培养基适用性检查
菌液制备 ❖ 一般当日使用。 ❖ 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌，少许接种
至营养肉汤基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸 盐流体培养基中，30～35℃培养18 ～24h； ❖ 白色念珠菌的新鲜培养物接种改良马丁培养基中， 23～28℃ 培养24 ～48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌 量小于100cfu/ml菌悬液； ❖ 黑曲霉 菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基 上， 23～28℃培养5 ～ 7天，使大量的孢子成熟。加入3～ 5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液， 将孢子洗脱。然后用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中， 用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制 成小于100cfu/ml 的孢子悬液。（见表）
➢ 硫乙醇酸盐培养管置：30～35℃培养14天。
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（5）培养基种类及要求
❖ 改良马丁培养基：取培养基成分混合，微 温溶解，调节PH值约为6.8，煮沸，摇匀， 调PH值灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。
❖ 改良马丁培养基：置23～28℃培养14天。
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（5）培养基种类及要求
培养基装量： ❖ 对于采用直接接种法检查的液体样品，培
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试验设备（5）--台式蒸汽灭菌器
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试验设备（6）-- 显 微 镜
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试验设备（7）-生物安全柜
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试验设备（8）Equinox 全自动无菌检验系统
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（4）实验环境条件要 求：
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局 部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离 系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操 作，防止微生物污染。单向流空气区、工作 台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区) 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的 现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按 相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度 须符合无菌检查的要求。
药典要求无菌的药品、原料、辅料及其 他品种是否无菌的一种方法。若供试品 符合无菌检查法的规定，仅表明了供试 品在该检验条件下未发现微生物污染。
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（2）无菌检验依据
➢ 本规范选用于《中国药典》2010年版 二部附录XI H无菌检查法。
➢ GB/T 14233.2-2005 《医用输液、输 血、注射器具检验方法 ，第二部分： 生物试验方法中规定的无菌试验方法。
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（3）试验主要设备
➢ 超净工作台 ➢ 细菌培养箱 ➢ 霉菌培养箱 ➢ 立式高压蒸汽灭菌器 ➢ 台式高压蒸汽灭菌器 ➢ 显微镜 ➢ 生物安全柜 ➢ 电热恒温干燥箱 ➢ 集菌仪
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试验仪器（1） - 超净工作台
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试验设备（2）--隔水式恒温培养箱
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试验设备（3）----霉菌培养箱
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试验设备（4）-立式高压蒸汽灭菌器
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（5）培养基种类及要求
保存时间： 制备好的培养基应保存在：2 ℃～25℃、 避光 ❖ 非密闭容器中：一般在三周内使用 ❖ 密闭容器中：一般可在一年内使用
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（5）培养基种类及要求
➢ 一般采用商品脱水培养基，临用时按照 使用说明书进行配制，配制时须迅速， 以免吸潮影响称量的准确性，同时需注 意灭菌后培养基的pH值应符合规定，否 则必须校正后灭菌使用。
养基的装量与供试品装量相关，应根据供 试品接种量确定培养基的装量，使供试品 接种体积不大于培养基的10%。 ❖ 对于采用直接接种法检查的固体样品，培 养基的装量均为100ml；一次性医用材料 及医疗器具，若医疗器具体积过大，培养 基的装量可2000ml以上，已将其完全浸 没为准。 ❖ 对于采用薄膜过滤法检查的样品，封闭式 薄膜滤器的培养基装量为100ml 。
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（6）培养基适用性检查
《中国药典》2010年无菌检查验证试验中使用7株菌见下表
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（6）培养基适用性检查
培养基接种
金黄色葡萄球菌2支 铜绿假单胞菌2支 硫乙醇酸盐流体培养基 枯草芽孢杆菌2支 生孢梭菌2支 9支培养基装量12ml，空白对照1支。
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（6）培养基适用性检查
菌种：试验用菌株及菌液制备： ❖ 金黄色葡萄球菌
[CMCC(B)26003 ❖ 铜绿色假单胞菌
[CMCC(B)10104] ❖ 大肠埃希菌[CMCC(B)44102] ❖ 枯草杆菌[CMCC(B)63501] ❖ 生孢梭菌[CMCC(B)64941] ❖ 白色念珠菌[CMCC(F)98001] ❖ 黑曲霉[CMCC(F)98003]
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（4）实验人员要求：
菌检人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术培训。
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（5）培养基种类及要求
❖ 硫乙醇酸盐流体培养基 ❖ 改良马丁培养基
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（5）培养基种类及要求
❖ 无菌检查：硫乙醇酸盐流体培养基
2012年12月
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（5）培养基种类及要求
无菌检查 ：改良马丁培养基：
2012年12月
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（6）培养基适用性检查
❖ 新购的培养基或自配的新鲜培养基要求： ❖ 无菌性检查： ❖ 每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，
应无菌生长。 ❖ 灵敏度检查： ❖ 其质量均应符合灵敏度检查要求。用于培养基灵敏
度检查的菌种如下：菌种的传代的次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代）。