原生质体的制备

拟南芥原生质体转化实验

每次做大反应（用于CO-IP）最多做8管，每管需3 ml 原生质体溶液，浓度为106 ，10 ml 酶液需要40片叶子。小反应用于用于做蛋白定位，每管需200 μl 原生质体溶液

叶片的选取：，取刚刚完全展开，叶面光滑，非凹凸不平的，最上面最中间的叶片，依次向下选取，取瘦长的，叶缘尖锐的叶片为佳。每四棵苗取8-10片叶子。

1．打开水浴锅，TM=55o C

2. 配40 ml酶解液(8种试剂)

Cellulose R10 0.6 g 不要粘在管壁上

Macrozyme R10 0.16 g

Mannitol(4 o C) 20 ml

KCl 0.4 ml

MES 4 ml

55 o C，10 min(严格，前边摇2-3次，待管壁不再粘有酶，溶液澄清就不用摇)

待酶液自然降至室温，加入0.4 mL CaCl2 母液以及15.2 mL DDW ，0.04 g BSA，放置于3．将0.4 M mannitol 滴至一次性培养皿上，将叶片切成细丝，一刀一刀断开切，忌来回蹭。4．23 o C酶解2 h (或3 h，放置时间较长的酶液)，40 rpm。收获前75 rpm，摇1 min。5．配PEG 100 ml用Mannitol(4 o C)

PEG 4000 40 g

DDW 30 ml

Mannitol 25 ml

CaCl2 10 ml

6．提前将BD 50 ml 离心管置于冰上，尼龙膜过滤收集原生质体，100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心

7．用5 ml 大枪头吸除酶液，原生质体多则把酶液吸净，少则留一点酶液，加入W5 10-20 ml （依量而定）洗涤。100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心

8．吸去上清，再加入W5 20 ml，轻摇离心管重悬原生质体。100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心。

9．加入3-9 ml Mmg重悬,使原生质体浓度达到106，冰上放置。

10．取50 ml离心管（大反应），每管加入120 μg 质粒/每一种，然后用枪吸打混匀，阴性对照加一种质粒，然后用水补齐使总体积一致，然后用枪吸打混匀。冰上放置。

11．50 ml离心管中加入3 ml 原生质体溶液，沿管壁缓慢加入，充分摇匀。

12．每次室温摇匀后随即每50 ml离心管加入3 ml PEG溶液，轻柔颠倒混匀，不要有PEG 溶液一点一点，而应是充分均匀的溶液。加完PEG后每管室温放置6 min。（PEG刚加入时要分层，否则转化效率不好）。

13．好的情况下，6 min后不应看见有沉渣。加入室温W5 10-12 ml ，马上混匀，终止反应。盖子一定不要盖得太紧，100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心。

14．用5 ml 枪吸除上清，留约5 ml ，再加入10 ml W5，100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心。

15．用5 ml 枪吸除上清，留约1-2 ml ，再加入10 ml W5，倾斜放置于白色白炽灯下，液体不要粘在盖子上，用一张白纸遮盖住(光不要太强)，放约10-12 h，然后进行后续试验。