细胞培养

细胞培养基本操作

一，清洗和消毒

胶塞的清洗

新老胶塞的清洗

1.2%NaOH 煮沸10-20分钟

2.用水冲洗后，用1%HCl 浸泡30分钟。

3.自来水冲洗，蒸馏水洗2-3次

4.一般冲洗：用洗衣粉清洗，自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍。

塑料器皿的清洗

1.2%NaOH浸泡

2.用1%HCl 浸泡30分钟

3.自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍

玻璃器皿的清洗

1.用试管刷和洗衣粉刷干净瓶子，用自来水冲10遍，确保将洗衣粉冲干净。

2.凉干后浸泡进酸缸，时间不得少于6小时。

3.捞酸后，用自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍，烤干。

手术器械的清洗

1.实验完成后，洗衣粉将其清洗一遍，凉干。

2.使用之前高温消毒或用75%的酒精浸泡。

高压锅的使用

培养基DMEM，胰酶的配制

DMEM的配制：

胰酶的配制：

抗生素的配制：

1.青霉素（80万单位/瓶）+无菌双蒸馏水2ml

2.链霉素（100万单位/瓶+无菌双蒸馏水2ml

将上述2ml的青霉素和2ml的链霉素混合在加入36ml的双蒸馏水配制成储备液。混匀，分装，-20O C 保存。

使用时，配制成0.5ml青-链霉素储备液/100ml培养基

3.庆大霉素8万单位/支×2支2ml/支×=4ml，加入无菌的双蒸馏水36ml配制成储备液。

-20O C保存，使用时，100ml培养基加1滴，终浓度为0.5-1ml/100ml培养基。

二，细胞培养

细胞株的传代培养法

1.吸去原来培养瓶中的培养基

2.PBS轻轻冲洗一遍，吸去。

3.用0.025%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化细胞，见细胞收缩后，吸去胰蛋白酶，

加入新的培养基终止消化

4.用吸管小心地吸取培养基反复吹打，分装在每一个培养瓶中。

内皮细胞原代培养方法：

1.在动物的颈动脉放血处死，无菌条件下分离主动脉；

2.清除动脉外壁的筋膜和脂肪，用PPS冲洗两次，沿正中剪开，内膜朝下切于已经滴

加少量0.1%胰酶和0.02%EDTA的培养皿中，20消化10min。用细胞挂子轻轻刮取内膜上的内皮细胞，置入加有RPMI-1460培养液（含20%小牛血清，2×105U/L青霉素和200mg/L链霉素）的培养瓶中。

3.置于培养箱内培养，约4-5天保长满整瓶，即进行传代。

细胞解冻方法

1、先准备37-39度温水；

2、从液氮罐中取出细胞，迅速放进水中，振摇至复温。

3、用吸管吸进培养瓶中，加进培养基，6小时后可换液，24小时可传代。

细胞冻存方法

1、选对数生长期的细胞，在收集细胞的24小时前换液一次；

2、吸除旧的培养液，消化，再加入旧的培养液终止消化；

3、合并细胞于一只试管中，用塞子塞好，离心2分钟，去掉上清液；

4、在细胞中加入90%血清（约18滴）和10%DMSO（约2滴），或用50%的血清，40%的

培养基，10%的DMSO；

5、放入冻存管中，与40C（10分钟）——-200C（2小时）——-40 0C（2小时）；

6、最后放入液氮罐中，登记。

细胞转染步骤

1、转染前24小时细胞快速传代，将细胞传至24孔板中，细胞数为1~3╳105/孔，24小时

后长至90%以上；

2、取0.8~1.0μg DNA到无血清/抗生素的F12/DMEM中，总体积50μl；

3、取1~3μLF到无血清/抗生素的F12/DMEM中，总体积50μl（混合5分钟，不要延长时

间）；

4、1和2混合，室温放置20分钟；

5、放置的最后的3分钟，吸去24孔板的培养基，用PB洗一遍，加入500μl不含血清和

抗生素的F12/DMEM；

6、将4加入到转染的24孔板中；

7、370C 5%CO2 温育6小时，弃去原培养基，加入新鲜的培养基；

8、恢复24—48小时后加抗生素进行筛选。注（2、3、4要用进口）

Fura-2操作步骤

一、细胞部分

1、用胰酶消化细胞，加入2ml原液终止消化；

2、负载：加10%BSA 20μl和2μl Fura –2

3、孵育25分钟，每隔8分钟吹一次；

4、50离心1分钟，控干液体，加入2ml测定液HBSS；

二、上机操作部分

1、POWER，开Xe lamp；

2、待屏幕出现READY，CHANGE +[10]↙+[1] ↙+[1] ↙

3、START/STOP（先后各一次即可）；

4、待屏幕出现READY，再一次CHANGE +[10]↙+[1] ↙+[2] ↙

5、出现READY后，按PAGE调Y轴基线至-3.39，调至8，调至128

6、按STRAT

三、存盘操作

1、DATA PROC +[2]；

2、将当前屏幕中文文件存入23号文件，输入23↙

3、DISK OPER+[1] ↙+[1] ↙

4、[1]=21↙[2]=（磁盘自编文件号）↙

5、重复3，操作[1]=22↙[2]=（磁盘自编文件号）↙

6、重复3，操作[1]=23或24↙[2]=（磁盘自编文件号）↙

7、DATA PROC +[4] ↙+ 23↙

四、调出文件操作

1、DISK OPER + [1] ↙+[2] ↙

2、[1]=（原22号文件）↙，[2]=（存入内存的空文件）；

3、DISK OPER + [1] ↙+[2] ↙

4、[1]=（原23号文件）↙，[2]=（存入内存的另一个空文件）；

基因转染技术

基因转染的概念

将目的基因导入体细胞，使其在细胞中得到表达，并产生相应功能的技术。基因转染的种类

磷酸钙法电击法脂质体法显微注射法逆转录病毒介导法其他稳定表达转染瞬时表达转染

基因转染的步骤

1.目的基因（DNA）的准备

包括环状的质粒DNA或片段DNA的制备

要求：纯度高，1.8

2.目的基因导入细胞（脂质体转染法为例）