飞行质谱仪检测样品的详细操作步骤.

五、校准样品谱图
校准样品有四种：
1、peptide calibration standard (~1000Da - ~4000Da) 简写为：pep_cal 2、protein calibration standard (~3000Da - ~25000Da) 简写为：pro Ⅰ _cal 3、protein calibration standard Ⅱ (~20000Da - ~70000Da) 简写为：pro Ⅱ _cal 4、oligonucleotide calibration standard (~3000Da - ~10000Da) 简写为：oligo_cal
仪器外观
主要性能指标
1、 线性模式飞行距离：1.22米；反射模式飞行距离：2.7米 2、 质量范围：可高达300,000道尔顿或更高 3、 分辨率： 线性模式：ACTH18-39(m/z=2465.2)，激光打30次，分辨率>4,000 反射模式：Somatostatin (m/z=3147),，激光打30次，分辨率>20,000 4、 灵敏度：1fmol ACTH18-39(m/z=2465.2)，激光打20次 线性模式 信噪比大于10：1； 反射模式 信噪比大于10：1 5、 质量准确度： 线性模式 质量准确度≤ 250 ppm。 反射模式 质量准确度≤ 60 ppm。
pep_cal的谱图
pro Ⅰ _cal的谱图
pro Ⅱ _cal的谱图
oligo_cal的谱图
六、举例
以下几张谱图供大家参考。
肽谱干净无杂质，清晰易准确标峰，检索结果得分值高
肽谱干净无杂质，清晰易准确标峰，检索结果得分值高
角蛋白污染严重
一组间隔均匀的峰，为质量较差的样品容器导致的污染， 并严重抑制了样品的电离。
质谱专家建议：跑胶、切胶、酶切、除盐等 操作过程中，尽量戴上手套、口罩、头帽 等，并选用较好的实验材料；不要使用不 挥发性盐，挥发性盐含量控制在20mM以 下，最好做 Ziptip 除盐处理。
较脏的样品，检测不到肽峰
七、特别说明
就象DNA测序仪的检测结果好坏与模板、测序纯化 反应等有关一样，MALDI-TOF检测结果主要取决于样 品前期处理的好坏. 一方面质量较差的容器、溶剂和角蛋白污染等会导 致谱图中含有大量的假样品峰. 另一方面，样品中盐的存在会抑制样品的离子化，最 终导致检测不到样品峰，所以要严格操作过程，控制好 样品中的含盐量。
一、样品制备
（一）准备基质溶液（Matrix preparation protocol） （说明：根据样品类型选用合适的基质，此处的HCCA适 于肽类和小分子蛋白） 1. 2. 3. Produce a saturated solution of HCCA in (acetonitrile : 0.1%TFA, 1 : 2 v/v) Mix solution in ultra sonic device Spin down excess matrix in a centrifuge (5 min at 14000 RpM) and use the clear supernatant
MALDI-TOF检测样品
详细操作过程
仪器名称： 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪（简称 MALDI-TOF）
型号：autoflex
主要功能与应用
1. 对生物大分子分子量的测定； 2. 对蛋白质进行高通量的鉴定(高纯度单一蛋白）； 3. 对有机小分子化合物分子量的测定； 4. 对寡核苷酸的分析； 5. 对基因的单核苷酸多态性的分析。 广泛应用于蛋白质组学、基因组学、分子生物学研究 领域。
第一种方法
登陆网站点击
设定各参数
调用 .peaklist 文件
点击开始
网上数据库检索结果
分值>76的区域
根据样品来源确定目标蛋白
点击选中的蛋白链接，则显示氨基酸序列等详细信息
蛋白序列信息
理论与检测值比较
检索结果
选中目标蛋白后，点击get hit(s)
Get hit(s)后显示的页面
可通过谱图，直观地查看峰的匹配情况
（二） 手动点靶（Preparation onto MALDI TOF-Target）
干点法（Dried droplet method）：最为常用的一ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ方法
1. 2.
Mix equal volumes of sample with HCCA Apply 1ul onto the target 按图示模式点靶
3.
Dry at room temperature
样 样 样
样 标 样
样 样 样
样 样 样
样 标 样
样 样 样
样品 “靶”（ MALDI TOF-Target）
“自动点靶设备
四、谱图解析
蛋白鉴定样品：进入下一步网上数据库检索
下面介绍： “肽指纹谱”网上数据库检索
两种方法： 一、登陆mascot网站，直接调用.peaklist文件，进行检索。 二、用biotools软件，打开样品的原始谱图，设定参数，重新 标峰，自动链接mascot网页，进行检索。将检索到的结果与 原始谱图比对，检查峰匹配情况。此法可以省略步骤（三、 标峰）