CAR-T-CD19治疗成人复发难治性BALL2015教程
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CAR-T-CD19治疗复发或难治性急 性B淋巴细胞白血病（B-ALL）
安徽医科大学血液病学系 第二附属医院血液内科 翟志敏
急性淋巴细胞白血病简介
• 血液肿瘤是中国十大高发恶性肿瘤之一，占肿瘤 发病率的第六位。尤其是急性淋巴细胞白血病多 发于青少年，是35岁以下人群发病率、病死率最
高的恶性肿瘤，其中B-ALL最为常见。(我国白血
被巨噬细胞吞噬的成熟红细胞
第1例：CAR-T回输后15d骨髓涂片细胞学检查 （ BM细胞）
回输后15d BM细胞
原始细胞（白血病细胞）
回输后33d BM细胞
骨髓增生极度低下
4. 结果 3）临床疗效（反应率）
3例外周血和骨髓均达到完全缓解，2例PR，1例病情稳 定。1例PR患者因长期粒缺、合并肺部重症感染死亡。
• 近期CD19嵌合抗原受体技术在治疗儿童和成人复 发B-ALL方面初步显示出很好疗效，近两年的
ASH会议上均有所报道。为了强调这个领域的重
要性，CAR-T疗法成为2014、2015年ASH年会中的
一个重点。
• 这种新型疗法为复发难治性B-ALL患者带来了一
线生机，尤其给那些此前各种实验疗法均失败、
ASH 2015：诺华CAR-T免疫疗法CTL019治疗儿科白 血病再现完美治疗潜力——完全缓解率达93%！
2015年第57届美国血液病学会（ASH）年会于12月5日8日在美国奥兰多举行。诺华（Novartis）在会上公布了 一项CAR-T免疫疗法CTL019的最新临床数据（ II期研 究），数据显示，59例复发/难治性急性淋巴细胞白血病 （r/r ALL）儿童及年轻成人患者接受CTL019治疗后，完 全缓解率达到了93%（n=55/59）。平均随访12个月的 数据显示，在12个月时总生存率为79%（95%CI，6991%），6个月时的无复发生存率为76%（95% CI, 6589%），12个月时的无复发生存率为55%（95% CI, 4273%）。18例患者在治疗后12个月继续保持完全缓解 （CR）。
均为难治性或反复复发（含髓外浸润3/6 ）的
男 ： 16岁 4例 女 ： 2例
~52岁 B-ALL，其中3例bcr/abl阳性（含1例B 髓双系 列混合型 AL ）， 1 例 t(4;11) 、 MLL-AF4 阳性 , 1例Pro-B-ALL伴 CD33、CD13表达，1例Pre-
Pre-B-ALL伴骨髓纤维化
引起的低丙种球蛋白血症。
3.神经系统毒性，几个研究组在用CAR-T治疗白血病的过程中 ，观察到少部分患者出现神经错乱，语言障碍，癫痫等神经
系统不良反应。
4.其他合并的免疫炎症反应，巨噬细胞活化，类自身免疫性疾 病等。
• 第1例患者 CAR-T细胞回输后虽然骨髓中白血病细 胞明显减少，但始终未能恢复正常造血，最终因持 续粒细胞缺乏，肺部重症感染离世。分析原因：
致谢：本科治疗采用的CAR-T细胞由安徽北大未名生物
经济研究院免费提供，CAR-T细胞制备和质量监控是在 美国贝勒医学院细胞与基因治疗中心宋晓彤教授指导下， 安徽北大未名生物经济研究院刘振云博士等实施完成。 安徽医科大学第二附属医院血液科目前还有4例正在接 受CAR-T-CD19治疗，密切观察中。
CD19
第1例
FCM 检测 治疗 后白 血病 细胞 清除 效率
1）2015-06-11 （回输前）
2）2015-07-01 （回输后7d）
3）2015-07-10 （回输后17d）
4）2015-07-27（回输后33d）
第2例
治疗前 BM BC ＞80%
治疗后22d,60d BM 完全缓解（ BC ﹤ 5%）
• 安医大二附院血液科与安徽北大未名生物经济研 究院合作领先在安徽首次开展CAR-T细胞治疗技 术。 • 初步的临床结果报告如下：
1. 病例选择：
1.1 复发难治性急性B淋巴细胞白血病（B-ALL） 患者经其他传统治疗手段无效，治疗前确认白 血病细胞CD19+。
复发难治性急性B淋巴细胞白血病定义： ①初治病人对标准诱导化疗无效（ALL 1个疗程，AML 两个疗程）；
向免疫因子对CAR-T细胞的凋亡诱导和抑制作
用。
二、清除白血病细胞的效能和临床疗效
2）细胞因素：体外制备CAR-T细胞的技术水平，细胞
数量、靶向性、杀伤活性和持久性为过继性细胞免
疫治疗的几个要素。能否获得足够数量的CAR-T细 胞？靶抗原的特异性和转染效率？杀伤功能和在体 内持续存活的时间？ 3） 回输CAR-T细胞前后的免疫调节：是否需要预处理？ 如何处理？回输前后是否需要联合使用IL-2等免疫细 胞因子？
无药可治的患者带来了希望。
CAR-T细胞治疗恶性肿瘤有多重优势：短时 间内扩增肿瘤特异的T细胞群，靶抗原的非HLA依 赖，可反复多疗程使用等。但作为是一种刚刚应 用于临床的新型治疗方法，还存在很多问题和未 确定因素需要进一步研究和探索，包括“CAR-T 细胞最基本的质量标准参数的制定和监控，回输 的最佳时机和方式，治疗相关不良反应及其控制， 以及近期、远期确切的治疗效果等等”。尤其对 中国的患者临床疗效如何？
4来自百度文库 结果
2）安全性：所有患者在回输细胞后均出现不同 程度的发热，一般均在37 ℃~ 38 ℃，偶然最高 可达39℃以上，但均为一过性，无畏寒、寒战、 心慌、胸闷等不适，无需特殊处理或仅用物理降 温即可退热。第1例患者在回输CAR-T 2周后复查 骨髓发现有嗜血现象，无其他严重毒副反应。
原始细胞（白血病细胞）
65% 0.13x109/L ，Hb 49g/L，PLT 15×109/L 。
二、清除白血病细胞的效能和临床疗效
1）宿主因素： ① 白血病细胞自身的生物学特性，如增殖活 性，浸润能力，干扰或逃逸免疫杀伤的能力等等。 ② 既 往用药和患者接受治疗时的基本免疫水平。
• 早期和目前的研究着重于稳定产生肿瘤靶向的 T细胞，而肿瘤周围抑制性的微环境却可能使 CAR-T细胞变得毫无效用。因此，未来这一疗 法的研究方向还应该考虑消除肿瘤微环境中负
病发病率约为3／10万一4／10万人口)
• 虽然化疗治疗儿童急性淋巴细胞白血病取得很好 的疗效，70% 以上患者可获得5年以上长期生存， 但在成人ALL疗效仍然很差，尤其是复发难治性急 性淋巴细胞白血病的患者预后极差，甚至即使接 受挽救性造血干细胞移植治疗，大多患者仅能获 得短期病情控制，如果是在异基因造血干细胞移 植之后复发或无条件接受移植治疗，该类患者基 本上处于无药可救境地。
第1例：治疗前骨髓中的白血病细胞﹥70%
第1例：治疗后15d骨髓中的白血病细胞＜ 20%
CD34
第1例
SSC
1）2015-06-11（回输前）
FCM 检测 治疗 后白 血病 细胞 清除 效率
2）2015-07-01 （回输后7d）
3）2015-07-10 （回输后17d）
4）2015-07-27（回输后33d）
胞学CR。bcr/abl（T315I突变）融合基因
P210 19.3%阳性 PB-RT-PCR 可检出微量CAR-T特异性核 苷酸片段。
微弱 阳性
讨 论
一、CAR-T治疗的安全性：CAR有多安全？
迄今为止报道的CAR T治疗相关副作用： 1.细胞因子风暴，肿瘤裂解效应、外周血中CAR-T细胞的数量 和促炎症细胞因子的水平直接相关。 2.靶向细胞毒性， B细胞再生性贫血障碍或瞄定CD19分子而
白血病细胞表面抗原CD19的 检测和鉴定
T淋巴细胞数量和亚型的 评估
2. 治疗方法： 用逆转录病毒载体导入CD19 CAR的自体T细
胞（CAR-T-CD19）输注给患者，输注剂量为
5×108~无上限，分3-5次回输。（细胞由安徽北
大未名生物经济研究院制备和提供）
• 回输前对体外制备的CAR-T细胞进行质量检 测和鉴定：
1）基本指标：数量、活性度、有无病原体等污染。 2）靶抗原转染率和细胞杀伤功能。
转染组
对照组
RT-PCR检测转染结果
CA R质 粒 患 者 阳 性 对 照 阴 性 对 照 CA R质 粒 患 者 阳 性 对 照 阳 性 对 照
CD19
GAPDH
Cp值
相对定量----Cp值与内参
Cp值平均数
样品名 CD19 GAP DH
① 治疗前患者一般情况极差，查PB ：WBC 0.73×109/L, N 6.8%, Neu 0.05×109/L, Ly 93.2% 0.68x109/L Hb 26g/L，PLT 10×109/L，骨 髓中原始细胞73%。经长期使用IL-2和支持治疗后，患者勉 强达到采血标准。 ② 既往长期反复强化疗，损伤正常造血干祖细胞，有继发再障 、MDS可能。 ③ 既往化疗时，曾反复合并肺部重症感染（包括肺真菌病）， 容易再次激活。 ④ 不排除巨噬细胞活化加重或延长粒细胞缺乏， 患者出院后 再次入院时查PB：WBC 0.2×109/L, N 30%, Neu 0.06×109/L, Ly
FCM检测转染结果
未转染细胞
转染后细胞
回输前T细胞亚群检测
CAR-T细胞回输前1周内，除予以小剂量环磷酰胺 (0.3g/M2 iv. -6d,-5d,-4d) 进行预处理帮助删除抑制性淋巴 细胞之外（也有患者采用FC），禁用其他一切细胞毒药 物和免疫抑制剂。回输时至少由三人（医生、护士和细 胞制备技术人员）对患者的姓名、性别、年龄、住院号、 细胞培养序列号和质控报告单等资料进行严格核对，确 认无误后再行回输，回输过程中密切观察患者情况。
3. 观察指标：
1）安全性，患者接受CAR-T-CD19治疗，可能出现的 各种相关不良反应及患者耐受性。 2）CAR-T-CD19体内清除白血病细胞效能。
3） CAR-T-CD19在体内持续存留的时间。
4. 结果
1）6例成人接受CAR-T-CD19治疗患者的一般情况
性别 年龄 临床诊断和既往治疗
第2例
治疗前
第2例
治疗后22d
第3例
治疗前 BM BC ＞70%
治疗后 BM BC ﹤ 35%
4. 结果
4）CAR-T在体内持续存留时间
第2例CAR-T回输后第60天，骨髓和外周血CR。PBRT-PCR 可检出CAR-T特异性核苷酸片段。3个月时测不 出。
第4例：CAR-T回输后第30天，骨髓和外周血细
②在首次缓解6个月内、即早期复发的白血病； ③虽然在首次缓解6个月后复发，但以原方案再诱导 治疗失败者； ④ 2次或2次以上复发的患者。
1.2 患者自愿入组参加，依从性好，能全程配合试 验观察，一般情况尚好，心、肝、肾功能基本正 常，无重症感染，采血时外周血CD3+T淋巴细胞 计数必须≥0.8x109/L。
L2（患者） 19.89 12.6 1 X1（阳参） 21.75 12.6 8 NC（阴参）36.27 14.1 9 注： L2为患者细胞，X1为另一组感染效率的对照细胞，NC为经过相同时间周期培养 的未感染的T细胞（NC-CD19的Cp值超过35，说明样品中没有模板）。 左侧CD19的引物位于CAR的scFv上，，正常的T细胞不表达；右侧为GAPDH， 作为上样内参；
安徽医科大学血液病学系 第二附属医院血液内科 翟志敏
急性淋巴细胞白血病简介
• 血液肿瘤是中国十大高发恶性肿瘤之一，占肿瘤 发病率的第六位。尤其是急性淋巴细胞白血病多 发于青少年，是35岁以下人群发病率、病死率最
高的恶性肿瘤，其中B-ALL最为常见。(我国白血
被巨噬细胞吞噬的成熟红细胞
第1例：CAR-T回输后15d骨髓涂片细胞学检查 （ BM细胞）
回输后15d BM细胞
原始细胞（白血病细胞）
回输后33d BM细胞
骨髓增生极度低下
4. 结果 3）临床疗效（反应率）
3例外周血和骨髓均达到完全缓解，2例PR，1例病情稳 定。1例PR患者因长期粒缺、合并肺部重症感染死亡。
• 近期CD19嵌合抗原受体技术在治疗儿童和成人复 发B-ALL方面初步显示出很好疗效，近两年的
ASH会议上均有所报道。为了强调这个领域的重
要性，CAR-T疗法成为2014、2015年ASH年会中的
一个重点。
• 这种新型疗法为复发难治性B-ALL患者带来了一
线生机，尤其给那些此前各种实验疗法均失败、
ASH 2015：诺华CAR-T免疫疗法CTL019治疗儿科白 血病再现完美治疗潜力——完全缓解率达93%！
2015年第57届美国血液病学会（ASH）年会于12月5日8日在美国奥兰多举行。诺华（Novartis）在会上公布了 一项CAR-T免疫疗法CTL019的最新临床数据（ II期研 究），数据显示，59例复发/难治性急性淋巴细胞白血病 （r/r ALL）儿童及年轻成人患者接受CTL019治疗后，完 全缓解率达到了93%（n=55/59）。平均随访12个月的 数据显示，在12个月时总生存率为79%（95%CI，6991%），6个月时的无复发生存率为76%（95% CI, 6589%），12个月时的无复发生存率为55%（95% CI, 4273%）。18例患者在治疗后12个月继续保持完全缓解 （CR）。
均为难治性或反复复发（含髓外浸润3/6 ）的
男 ： 16岁 4例 女 ： 2例
~52岁 B-ALL，其中3例bcr/abl阳性（含1例B 髓双系 列混合型 AL ）， 1 例 t(4;11) 、 MLL-AF4 阳性 , 1例Pro-B-ALL伴 CD33、CD13表达，1例Pre-
Pre-B-ALL伴骨髓纤维化
引起的低丙种球蛋白血症。
3.神经系统毒性，几个研究组在用CAR-T治疗白血病的过程中 ，观察到少部分患者出现神经错乱，语言障碍，癫痫等神经
系统不良反应。
4.其他合并的免疫炎症反应，巨噬细胞活化，类自身免疫性疾 病等。
• 第1例患者 CAR-T细胞回输后虽然骨髓中白血病细 胞明显减少，但始终未能恢复正常造血，最终因持 续粒细胞缺乏，肺部重症感染离世。分析原因：
致谢：本科治疗采用的CAR-T细胞由安徽北大未名生物
经济研究院免费提供，CAR-T细胞制备和质量监控是在 美国贝勒医学院细胞与基因治疗中心宋晓彤教授指导下， 安徽北大未名生物经济研究院刘振云博士等实施完成。 安徽医科大学第二附属医院血液科目前还有4例正在接 受CAR-T-CD19治疗，密切观察中。
CD19
第1例
FCM 检测 治疗 后白 血病 细胞 清除 效率
1）2015-06-11 （回输前）
2）2015-07-01 （回输后7d）
3）2015-07-10 （回输后17d）
4）2015-07-27（回输后33d）
第2例
治疗前 BM BC ＞80%
治疗后22d,60d BM 完全缓解（ BC ﹤ 5%）
• 安医大二附院血液科与安徽北大未名生物经济研 究院合作领先在安徽首次开展CAR-T细胞治疗技 术。 • 初步的临床结果报告如下：
1. 病例选择：
1.1 复发难治性急性B淋巴细胞白血病（B-ALL） 患者经其他传统治疗手段无效，治疗前确认白 血病细胞CD19+。
复发难治性急性B淋巴细胞白血病定义： ①初治病人对标准诱导化疗无效（ALL 1个疗程，AML 两个疗程）；
向免疫因子对CAR-T细胞的凋亡诱导和抑制作
用。
二、清除白血病细胞的效能和临床疗效
2）细胞因素：体外制备CAR-T细胞的技术水平，细胞
数量、靶向性、杀伤活性和持久性为过继性细胞免
疫治疗的几个要素。能否获得足够数量的CAR-T细 胞？靶抗原的特异性和转染效率？杀伤功能和在体 内持续存活的时间？ 3） 回输CAR-T细胞前后的免疫调节：是否需要预处理？ 如何处理？回输前后是否需要联合使用IL-2等免疫细 胞因子？
无药可治的患者带来了希望。
CAR-T细胞治疗恶性肿瘤有多重优势：短时 间内扩增肿瘤特异的T细胞群，靶抗原的非HLA依 赖，可反复多疗程使用等。但作为是一种刚刚应 用于临床的新型治疗方法，还存在很多问题和未 确定因素需要进一步研究和探索，包括“CAR-T 细胞最基本的质量标准参数的制定和监控，回输 的最佳时机和方式，治疗相关不良反应及其控制， 以及近期、远期确切的治疗效果等等”。尤其对 中国的患者临床疗效如何？
4来自百度文库 结果
2）安全性：所有患者在回输细胞后均出现不同 程度的发热，一般均在37 ℃~ 38 ℃，偶然最高 可达39℃以上，但均为一过性，无畏寒、寒战、 心慌、胸闷等不适，无需特殊处理或仅用物理降 温即可退热。第1例患者在回输CAR-T 2周后复查 骨髓发现有嗜血现象，无其他严重毒副反应。
原始细胞（白血病细胞）
65% 0.13x109/L ，Hb 49g/L，PLT 15×109/L 。
二、清除白血病细胞的效能和临床疗效
1）宿主因素： ① 白血病细胞自身的生物学特性，如增殖活 性，浸润能力，干扰或逃逸免疫杀伤的能力等等。 ② 既 往用药和患者接受治疗时的基本免疫水平。
• 早期和目前的研究着重于稳定产生肿瘤靶向的 T细胞，而肿瘤周围抑制性的微环境却可能使 CAR-T细胞变得毫无效用。因此，未来这一疗 法的研究方向还应该考虑消除肿瘤微环境中负
病发病率约为3／10万一4／10万人口)
• 虽然化疗治疗儿童急性淋巴细胞白血病取得很好 的疗效，70% 以上患者可获得5年以上长期生存， 但在成人ALL疗效仍然很差，尤其是复发难治性急 性淋巴细胞白血病的患者预后极差，甚至即使接 受挽救性造血干细胞移植治疗，大多患者仅能获 得短期病情控制，如果是在异基因造血干细胞移 植之后复发或无条件接受移植治疗，该类患者基 本上处于无药可救境地。
第1例：治疗前骨髓中的白血病细胞﹥70%
第1例：治疗后15d骨髓中的白血病细胞＜ 20%
CD34
第1例
SSC
1）2015-06-11（回输前）
FCM 检测 治疗 后白 血病 细胞 清除 效率
2）2015-07-01 （回输后7d）
3）2015-07-10 （回输后17d）
4）2015-07-27（回输后33d）
胞学CR。bcr/abl（T315I突变）融合基因
P210 19.3%阳性 PB-RT-PCR 可检出微量CAR-T特异性核 苷酸片段。
微弱 阳性
讨 论
一、CAR-T治疗的安全性：CAR有多安全？
迄今为止报道的CAR T治疗相关副作用： 1.细胞因子风暴，肿瘤裂解效应、外周血中CAR-T细胞的数量 和促炎症细胞因子的水平直接相关。 2.靶向细胞毒性， B细胞再生性贫血障碍或瞄定CD19分子而
白血病细胞表面抗原CD19的 检测和鉴定
T淋巴细胞数量和亚型的 评估
2. 治疗方法： 用逆转录病毒载体导入CD19 CAR的自体T细
胞（CAR-T-CD19）输注给患者，输注剂量为
5×108~无上限，分3-5次回输。（细胞由安徽北
大未名生物经济研究院制备和提供）
• 回输前对体外制备的CAR-T细胞进行质量检 测和鉴定：
1）基本指标：数量、活性度、有无病原体等污染。 2）靶抗原转染率和细胞杀伤功能。
转染组
对照组
RT-PCR检测转染结果
CA R质 粒 患 者 阳 性 对 照 阴 性 对 照 CA R质 粒 患 者 阳 性 对 照 阳 性 对 照
CD19
GAPDH
Cp值
相对定量----Cp值与内参
Cp值平均数
样品名 CD19 GAP DH
① 治疗前患者一般情况极差，查PB ：WBC 0.73×109/L, N 6.8%, Neu 0.05×109/L, Ly 93.2% 0.68x109/L Hb 26g/L，PLT 10×109/L，骨 髓中原始细胞73%。经长期使用IL-2和支持治疗后，患者勉 强达到采血标准。 ② 既往长期反复强化疗，损伤正常造血干祖细胞，有继发再障 、MDS可能。 ③ 既往化疗时，曾反复合并肺部重症感染（包括肺真菌病）， 容易再次激活。 ④ 不排除巨噬细胞活化加重或延长粒细胞缺乏， 患者出院后 再次入院时查PB：WBC 0.2×109/L, N 30%, Neu 0.06×109/L, Ly
FCM检测转染结果
未转染细胞
转染后细胞
回输前T细胞亚群检测
CAR-T细胞回输前1周内，除予以小剂量环磷酰胺 (0.3g/M2 iv. -6d,-5d,-4d) 进行预处理帮助删除抑制性淋巴 细胞之外（也有患者采用FC），禁用其他一切细胞毒药 物和免疫抑制剂。回输时至少由三人（医生、护士和细 胞制备技术人员）对患者的姓名、性别、年龄、住院号、 细胞培养序列号和质控报告单等资料进行严格核对，确 认无误后再行回输，回输过程中密切观察患者情况。
3. 观察指标：
1）安全性，患者接受CAR-T-CD19治疗，可能出现的 各种相关不良反应及患者耐受性。 2）CAR-T-CD19体内清除白血病细胞效能。
3） CAR-T-CD19在体内持续存留的时间。
4. 结果
1）6例成人接受CAR-T-CD19治疗患者的一般情况
性别 年龄 临床诊断和既往治疗
第2例
治疗前
第2例
治疗后22d
第3例
治疗前 BM BC ＞70%
治疗后 BM BC ﹤ 35%
4. 结果
4）CAR-T在体内持续存留时间
第2例CAR-T回输后第60天，骨髓和外周血CR。PBRT-PCR 可检出CAR-T特异性核苷酸片段。3个月时测不 出。
第4例：CAR-T回输后第30天，骨髓和外周血细
②在首次缓解6个月内、即早期复发的白血病； ③虽然在首次缓解6个月后复发，但以原方案再诱导 治疗失败者； ④ 2次或2次以上复发的患者。
1.2 患者自愿入组参加，依从性好，能全程配合试 验观察，一般情况尚好，心、肝、肾功能基本正 常，无重症感染，采血时外周血CD3+T淋巴细胞 计数必须≥0.8x109/L。
L2（患者） 19.89 12.6 1 X1（阳参） 21.75 12.6 8 NC（阴参）36.27 14.1 9 注： L2为患者细胞，X1为另一组感染效率的对照细胞，NC为经过相同时间周期培养 的未感染的T细胞（NC-CD19的Cp值超过35，说明样品中没有模板）。 左侧CD19的引物位于CAR的scFv上，，正常的T细胞不表达；右侧为GAPDH， 作为上样内参；