单抗制备小鼠免疫SOP
小鼠单克隆抗体制备流程
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单克隆抗体制备技术
单克隆抗体制备技术单克隆抗体制备标准化操作方案（McAb—sop）第一章：小鼠免疫第二章：细胞融合第三章: 细胞建株第四章：细胞株鉴定第五章：腹水制备第六章：抗体纯化和鉴定(略）第一章. 小鼠免疫（BALB/c）小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证.一.小鼠免疫分两程方案：根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下:1.短程免疫方案:第一次: 1d 100ug（可溶性Ag)+等体积完全佐剂。
腹腔注射。
0.4ml/只第二次: 7d 100ug+等体积不完全佐剂腹腔注射。
0.4ml/只第三次: 12d 50ug IV 0.3ml/只(强化）第四次：15d 20ug IV 0。
3ml/只第17 d~24d内融合2长程免疫方案:第一次: 1d 100ug+等体积完全佐剂腹腔注射（IP）0。
4ml/只第二次: 14d 100ug+等体积不完全佐剂IP 0。
4ml/只第三次：21d 100ug IP或IV 0.4ml/只第四次: 25d 50ug IV 0.3ml/只(强化）第五次: 28d 20ug IV 0.3ml/只第30d~37d内融合。
注意:a。
在融合前(即加强免疫前)必须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1：32000,方可做融合。
b。
免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合. 否则不能保证融合质量.二．小鼠免疫质控标准1．免疫鼠血清滴度短程≥1:8000，长程≥1：32000；2．小鼠免疫后需在一周内做完融合；3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。
免疫鼠选择：免疫种类为：balb/c小鼠；性别。
雌性佳；大小:6—7周龄：体重：20g;健壮。
活泼。
第二章．细胞融合一．融合前准备1．脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏,并制成单个脾细胞悬液,每只鼠的脾细胞约1～3亿.在制备过程中严格保证无菌。
制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。
单克隆抗体的制备方法
单克隆抗体的制备方法
单克隆抗体的制备方法主要包括以下几个步骤：
1. 免疫兔或小鼠：首先选择一个目标抗原，这可能是一种蛋白质、多肽或其他分子。
然后，将该抗原注射到实验动物（通常是免疫兔或小鼠）的体内，以刺激其免疫系统产生抗原特异性的抗体。
2. 細胞樹突瘤：在动物体内产生抗体后，从其体内提取淋巴细胞，通常是从脾脏或骨髓中获得。
然后，将这些淋巴细胞融合到特定的癌细胞（如骨髓瘤细胞）中，形成融合细胞，称为淋巴瘤细胞。
3. 杂交瘤筛选：将淋巴瘤细胞培养在富含饲养基的培养皿中，使其成长为一种混合的细胞群。
然后，利用对抗体特异性的检测方法，如ELISA或流式细胞术，筛选出对目标抗原具有高亲和力和高特异性的单克隆抗体产生的杂交瘤细胞。
4. 单克隆抗体培养和纯化：将筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞进行扩增培养，并采用特定培养基和条件，如添加低髓酸和高髓酸补充物，以增加单克隆抗体的产量。
随后，通过离心、净化和纯化等步骤，从培养物中分离和纯化出单克隆抗体。
5. 验证和应用：对制备的单克隆抗体进行验证，包括测定其亲和力、特异性和功能等方面。
然后，将其应用于各种实验和临床研究领域，如免疫组织化学、免
疫印迹、流式细胞术和免疫疗法等。
需要注意的是，单克隆抗体的制备过程较为繁琐和耗时，并且存在一定的技术挑战。
因此，近年来还出现了许多其他方法来制备单克隆抗体，如基因工程技术和体外抗体筛选技术等，可以更快速和高效地得到目标单克隆抗体。
单抗制备小鼠免疫SOP
单抗制备免疫一、材料准备：弗式完全佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）实验动物：小鼠（Balb/c）雌性，8周以上,体重20g以上每种抗原蛋白免疫小鼠4只靶抗原：具有免疫原性的抗原或蛋白质、多肽，生理盐水抗原要求：抗原要尽量在无毒无刺激溶液中（PBS或生理盐水），纯度大于80%，浓度1mg/ml以上，总量大于2mg。
抗原尽量是可溶性抗原，溶液为PBS，如必需加入刺激物质，SDS浓度在0.5%以下，尿素在2M以下，不含咪唑，丙烯酰胺等变性剂，要求溶液澄清，无沉淀。
二、实验步骤1.抗原准备：每只小鼠按照100ug/100ul蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。
2.抗原-佐剂的准备：将抗原液与佐剂混合制成乳状液，抗原与佐剂混合按照1：1比例进行，加入搅拌子后于4度搅拌过夜。
注射量为200ul 每只小鼠，抗原量为100ug。
第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后加强使用弗氏不完全佐剂，最后一次加强不加佐剂，免疫前采集阴性血做为对照，乳化因考虑损失，多计算两只小鼠的量。
乳化完全判断标准：挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定，如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。
将乳状液移入1ml注射器。
3.小鼠免疫：将小鼠放在鼠笼上，拉住小鼠尾尖部，背部75%酒精消毒，针头15度角刺入小鼠皮下，挑起注射。
皮下注射共200ul，分5个点（背部皮下任意点）4.冲击免疫：如计划在免疫3d后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原进行直接脾脏免疫。
过程：将小鼠在固定架上固定，脾脏位置毛剪掉并消毒，快速分别剪开外皮和内皮，将脾脏拉出，吸取100ul/100ug抗原注入脾脏内，并快速用手术线分别缝合内皮和外皮。
5.小鼠阳性血清采集：尾部剪尾采血20ul，用生理盐水稀释10倍，离心收集上清。
6.效价检测：间接法检测小鼠多抗血清效价。
单抗的制备方案（很详尽）
单抗的制备方案首先制备抗原明白所做工作的目的，了解抗原的免疫原性和反应原性。
确定免疫方案既确定抗原的免疫特性是什么来根据此制定合适的小鼠免疫方案。
对于可溶性抗原和颗粒性抗原的方案有不同的免疫程序可以查阅文献或者做一些预实验。
免疫后取脾进行细胞融合细胞融合前的准备骨髓瘤细胞系的选择常用的为SP2/0细胞系饲养细胞的选择一般常用的为小鼠腹腔巨噬细胞细胞融合的步骤制备饲养细胞层暴露处理好的小鼠腹膜反复冲洗吸出冲洗液冲洗液离心加入小牛血清培养液混悬加入96孔板放入培养箱制备免疫脾细胞最后免疫小鼠后拉颈处死无菌取脾脏洗一次后研碎过不锈钢筛网离心细胞用培养液洗2次计数取108脾淋巴细胞悬液备用制备骨髓瘤细胞取对数生长的骨髓瘤细胞离心用培养液洗2次计数取x107细胞备用融合选择杂交瘤细胞及抗体检测HA T选择杂交瘤细胞抗体的检测根据抗原的性质抗体的类型不同选择不同的筛选方法。
常用的方法放免，ELISA，免疫荧光，间接血凝杂交瘤的克隆化抗体阳性孔的克隆化，检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体分泌的细胞所抑制。
克隆化的方法很多常用的是有限稀释法和软琼脂平板法杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存细胞的复苏单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的鉴定抗体特异性的鉴定，除用免疫原进行抗体的检测外还应该用于其抗原成分相关的其他抗原进行交叉实验。
McAb的ig类和亚类的鉴定分别用抗体的ig类型和ig亚类血清作双扩和夹心ELISA进行检测单抗中和活性的鉴定：用动物或细胞的保护实验来确定单抗的生物学活性。
单抗识别抗原表位的鉴定：用竞争结合实验测相加指数的方法测定单抗所识别抗原位点，赖确定单抗识别的表位是否相同。
单抗亲和力的鉴定用ELISA或RIA竞争结合实验来确定单抗与相应抗原结合的亲合力。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
SOP-True Blot抗体
True blot多抗的制备抗体：小鼠IgG山羊抗小鼠IgGHRP-标记的抗山羊IgG抗体抗原性抗体（小鼠IgG）的变性：方案一1. 抗原性抗体溶液加入使终浓度为0.1％SDS， 2－巯基乙醇，沸水5分钟。
2. G－25脱盐柱除去2－巯基乙醇。
3. 置透析袋，对含有 M半胱氨酸的PBS缓冲液透析，4C过夜。
4. 非还原SDS-PAGE分析，检测氧化性抗体的含量。
5. 置透析袋对PBS充分透析除去半胱氨酸。
方案二1．抗原性抗体溶液加入SMCC使终浓度与蛋白浓度比为1：5。
变性抗体与凝胶的连接：采用-NH2方法。
山羊抗小鼠抗体经凝胶吸附：1.抗小鼠抗体适量与凝胶室温下充分混合2小时。
2.装入P10柱，收集流穿液（目的成分）。
3.大量PBS淋洗凝胶后，以0.1M甘氨酸（PH 3.0）洗脱，根据紫外280nm吸收值收集洗脱的蛋白组分。
4.流穿液和洗脱液检测280/260nm吸收值计算蛋白浓度。
5.流穿液和洗脱液进行SDS-PAGE分析。
（必要时重复以上实验一次）目的抗体的印迹分析：1.小鼠IgG SDS-PAGE。
2.转膜至NC膜。
3.膜封闭后分别加入0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10ug/ml的经特异吸附的(目的抗体)和未经吸附的山羊抗小鼠IgG抗体。
4.洗膜后加入HRP－标记的抗山羊IgG抗体。
5.DAB显色。
6.比较同一浓度下两种抗体（经吸附和未经吸附）显色带的差异，确定未经吸附抗体显色而经吸附抗体未显色的浓度范围。
True blot单抗的制备动物：Balb/c小鼠、Lewis大鼠免疫剂量：200μg/次。
免疫容积：0.5ml/鼠/次。
免疫部位：背部皮下，多部位/次，末次采用腹腔或静脉注射（相同剂量免疫原但不含助剂）。
免疫方案：d0 第一次免疫注射，采用CFA。
d21 第二次免疫注射,采用IFA。
d35 尾静脉或眼眶静脉采血0.3－0.5ml，提取血清进行ELISA检测和/或Western blot。
单克隆抗体制备试验过程
单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
说明：FCA弗氏完全佐剂；FIA,弗氏不完全佐剂；Quickantibody,北京康碧泉公司研制的佐剂。
上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合(Cellfusion)【材料和试剂】(1)骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
(2)免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离血清冻存备用。
拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3〜5min。
无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3〜5个小块，然后用注射器内芯研磨。
将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml,1000r/min离心5min,弃上清，再以同法洗涤离心一次。
然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得〜2x108个脾细胞。
(3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镣从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。
单抗制备实验报告
一、实验背景单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，由单个B细胞克隆产生。
单抗在生物医学研究、疾病诊断、治疗药物研发等领域具有广泛的应用。
本实验旨在通过细胞融合技术制备小鼠单克隆抗体，并对其特异性、亲和力和效价进行鉴定。
二、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠，体重18-22g。
2. 试剂与耗材：淋巴细胞分离液、Ficoll、RPMI-1640培养基、胎牛血清、链霉素、青霉素、聚乙二醇（PEG）、小鼠抗小鼠IgG-FITC、兔抗小鼠IgG-HRP、ELISA 试剂盒、抗体稀释液、抗体亲和层析柱等。
3. 仪器：超净工作台、显微镜、酶标仪、离心机、冰箱、培养箱等。
三、实验方法1. 动物免疫（1）选择雌性小鼠，将其随机分为两组，每组10只。
（2）对实验组小鼠进行免疫，每次免疫剂量为1mg抗原，间隔2周进行第2次免疫。
（3）对照组小鼠仅给予生理盐水注射。
2. 细胞分离与培养（1）免疫后第3周，处死实验组小鼠，无菌操作取出脾脏。
（2）将脾脏剪碎，加入Ficoll分层液，进行细胞分离。
（3）收集单个核细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次，计数。
（4）将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行混合，加入PEG进行细胞融合。
（5）将融合后的细胞进行培养，选择杂交瘤细胞。
3. 单抗制备（1）将杂交瘤细胞进行扩大培养，收集培养上清。
（2）用ELISA试剂盒检测培养上清中的抗体效价，筛选出高亲和力抗体。
（3）将高亲和力抗体进行亲和层析纯化。
4. 单抗鉴定（1）用小鼠抗小鼠IgG-FITC和兔抗小鼠IgG-HRP进行Western blot检测，鉴定单抗的特异性。
（2）用ELISA试剂盒检测单抗的效价。
（3）用抗体亲和层析柱对单抗进行亲和力测定。
四、实验结果1. 动物免疫实验组小鼠在免疫过程中未出现明显异常，免疫成功。
2. 细胞分离与培养成功分离出脾细胞和骨髓瘤细胞，细胞融合率为90%。
小鼠单克隆抗体的制备
小鼠单克隆抗体的制备小鼠单克隆抗体是利用小鼠免疫系统产生的B细胞，经过细胞融合技术获得的单克隆抗体。
这种抗体具有高亲和力和高特异性，可用于治疗和诊断多种疾病，是目前最常用的单克隆抗体制备方式之一。
1. 免疫小鼠选择目标抗原，一般为蛋白质或多肽。
将抗原与佐剂混合后注射给小鼠，以激发小鼠B细胞产生特异性抗体。
免疫方案应根据抗原的种类、大小和来源等因素进行优化，一般需要进行多次免疫。
2. 制备小鼠脾细胞将小鼠处死，取出脾脏，用PBS洗涤并制备单细胞悬液。
可采用机械打碎法、酶消化法等方法提取脾细胞。
3. 合并小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞将小鼠脾细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞混合，使用聚乙二醇或电融合等方法融合成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有小鼠脾细胞的抗原识别能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。
4. 限制杂交瘤的生长并筛选细胞可使用一些特定的选择剂或条件限制杂交瘤细胞的生长，如耳蜗毒素（HAT）缺失培养基等。
在特定条件下，只有细胞融合后获得完整染色体的杂交瘤细胞才能存活。
存活的杂交瘤细胞称为单克隆细胞，并通过ELISA等方法筛选出目标抗体的阳性细胞。
5. 扩增单克隆细胞并提取抗体将单克隆细胞进行扩增即可获得大量的目标抗体。
提取抗体可使用乙酸铵等方法，得到纯度较高的抗体液。
小鼠单克隆抗体制备的优点是制备简便、成本低廉，且能够获得高特异性的抗体。
但是，由于小鼠单克隆抗体来源于小鼠免疫系统，因此可能存在的抗原表位的差异、抗体的可溶性和稳定性等问题需要仔细考虑。
此外，还需要注意到小鼠单克隆抗体的制备和饲养过程中可能存在的伦理道德问题。
因此，在抗体制备过程中需注意合理规划实验设计，遵守伦理规范。
单克隆抗体的制备标准流程
单克隆抗体旳制备流程（一）动物旳选择与免疫1．动物旳选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝旳活动范畴小，体弱，食量及排污较小，一般环境干净旳实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术旳实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适旳免疫方案对于细胞融合杂交旳成功，获得高质量旳McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原旳特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不适宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是某些弱抗原）旳免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原旳免疫原性，另一方面可减少抗原旳使用量。
②变化抗原注入旳途径，基本免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体旳免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原旳反映性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得较好旳免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时规定抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107/0.5ml ip↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv↓取脾融合（二）细胞融合1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系旳选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散旳细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞，则可增进这些细胞生长繁殖，所加入旳这种细胞数被称为饲养细胞。
单抗制备操作规程
单抗制备操作规程单抗（monoclonal antibody）是指一种单一免疫球蛋白，它可以特异性地和抗原结合，用于诊断、治疗和研究不同疾病。
单抗制备是一项复杂的工作，需要准确控制多个关键步骤，下面是一个简化版本的单抗制备操作规程。
请注意，由于操作的精细性和复杂性，操作规程的详细程度可能因实验具体情况而有所不同。
1. 免疫原制备a. 根据实验需要，选择合适的抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、糖蛋白等。
b. 准备抗原的纯度要求高，可以通过自制或购买商业纯化抗原。
c. 对纯化后的抗原进行质量检测，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、SDS-PAGE等。
2. 动物免疫a. 选择合适的实验动物，常见的包括小鼠、大鼠、兔子等。
b. 注射一定剂量的抗原到动物体内，通常是通过多次免疫来诱导免疫反应。
c. 免疫前，检查动物的健康状况并确保其免疫力兴盛。
d. 在免疫周期中，对动物进行定期血样采集，检测免疫反应的效果。
3. 单克隆细胞的制备a. 免疫反应结束后，从动物身上采集免疫细胞（如脾脏、淋巴结等）。
b. 对细胞进行分离和稀释，以保证单个细胞的生长。
c. 制备培养基和培养条件，确保细胞的正常生长和营养供应。
d. 进行单克隆分离，筛选出特异性抗体的单克隆细胞。
4. 单抗的筛选和鉴定a. 将单克隆细胞进行扩增培养，并进行抗体的检测。
可以使用ELISA、免疫组织化学等方法。
b. 对候选单抗进行亲和力和特异性的检测，如亲和力柱层析、酵素标记的免疫组织化学等。
c. 从候选单抗中选择出高亲和力和特异性的抗体，作为最终的单抗。
5. 单抗的纯化和制备a. 选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等，对单抗进行纯化。
b. 进一步对纯化的单抗进行浓缩和储存，以便后续的实验和应用。
6. 单抗的应用a. 单抗可以用于多种实验和应用，包括免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质检测等。
b. 进行实验前，根据实验目的和要求，对单抗进行稀释和优化。
在整个单抗制备的过程中，实验者需要严格控制各个步骤的条件和细节，以确保单抗的质量和特异性。
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体的制备过程单克隆抗体是指由同一B细胞克隆所产生的一种单一的抗体，其具有高度的特异性和亲和力，具有广泛的应用价值。
单克隆抗体制备的过程一般包括以下步骤：免疫原制备，小鼠免疫，细胞融合，杂交瘤筛选，单克隆抗体生产和纯化等步骤。
1. 免疫原制备免疫原是用来诱导机体产生抗体的物质。
为了制备单克隆抗体，首先需要制备合适的免疫原。
免疫原可以是纯化的蛋白质、多肽、糖蛋白、核酸等，也可以是细胞、细胞培养上清液、细胞膜片、疫苗等。
免疫原的制备需要符合一定的要求，包括结构和活性的稳定性、纯度和规格的标准化、不含任何污染物等。
2. 小鼠免疫将制备好的免疫原注射到小鼠或其它实验动物体内，诱导小鼠产生特异性的抗体。
在免疫之前，需要将小鼠进行种系的选择和饲养。
选择常用鼠种，如BALB/c、C57BL/6等，确保其健康、年龄在8周以上，体重在18-25g之间。
免疫的剂量、时间和方法需要根据具体的免疫原和实验要求进行设计，一般需要多次免疫以提高抗体水平。
3. 细胞融合将免疫小鼠的脾脏细胞和髓样瘤细胞进行细胞融合，形成杂交瘤。
髓样瘤细胞是一类具有长生命周期和稳定倍体性的癌细胞，能够稳定地分泌特异性的抗体。
常用的髓样瘤细胞有SP2/0、NS0、Ag8.653等。
细胞融合需要尽可能快速地进行，以避免细胞凋亡和杂交失败的风险。
4. 杂交瘤筛选通过细胞融合，融合细胞能够产生杂交瘤，但只有其中一部分杂交瘤能够稳定分泌所需的单克隆抗体。
因此，需要对产生的杂交瘤进行筛选。
筛选的方法有很多种，常用的包括酶标记法、细胞增殖法、流式细胞术等。
筛选出来的单克隆细胞株可以通过多次传代稳定继续分泌高水平的单克隆抗体。
5. 单克隆抗体生产和纯化得到单克隆细胞株之后，需要进行单克隆抗体的生产和纯化。
通常采用的方法包括体外培养和体内产生。
在体外培养的情况下，需要选择合适的培养基、培养温度和CO2浓度，同时控制培养时间和培养密度等因素。
在体内产生的情况下，可以将单克隆细胞株移植到小鼠腹腔中，通过腹腔注射抗体产生的刺激剂，刺激小鼠体内产生大量的单克隆抗体。
单克隆抗体制备资料
3 筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选 特异单抗的方法最好
七、杂交瘤细胞克隆
在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能 混有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克 隆在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失， 为了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应 对细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来说， 杂交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。
3 融合的细胞要处于对数生长期
三、饲养细胞的制备
1 取清洁级ICR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min
2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤 4 用20mL注射器吸取15mLMEM营养液，注入 小鼠腹腔
5 轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几 次， 将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞 瓶内待用
9 将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔23滴，约0.1-0.15mL
10 将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2 培养 箱中培养
11 培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观 察细胞融合情况
12 培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2 13 7-8天用HT培养基换液，全部换液 14 10-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，
4 一个克隆需亚克隆3-4次，才稳定
5 如有孔污染，可向感染孔及临近孔滴加 1mol/mL的Cu SO4溶液
七、实验室规模抗体制备
体外上清液培养 1 杂交瘤细胞先在25mL 的细胞培养瓶中培养 2 细胞长满瓶底后转至50或100mL的细胞培 养瓶中培养 3 当细胞液变黄后，收集上清液，再加新鲜的 培养液，并重复收集上清2次 4让细胞长至饱和状态，直至死亡，并收集上 清
单克隆抗体制备方案
单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、动物免疫1.1 动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
1.2免疫原制备15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇）50μg /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入7mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入3mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入2mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
单克隆抗体制备标准化操作方案
单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop)第一章: 小鼠免疫第二章: 滋养细胞的制备第三章: 细胞融合第四章: 筛选分泌抗体的杂交瘤细胞 (ELISA法) 第五章: 杂交瘤细胞的亚克隆培养第六章: 杂交瘤细胞系的冻存与复苏第七章：腹水制备第八章：附件第一章小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。
好的免疫效果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。
小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。
但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。
上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。
常用的免疫方案：（一）可溶性抗原初次免疫： 50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。
（二）颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。
单克隆抗体制备规范操作
单克隆抗体制备规范操作融合准备工作：融合前3天小鼠追加免疫，用灭菌的2兆水稀释抗原，足掌免疫100微克抗原/鼠，50微克/脚，50微升/脚，注意追加免疫后3-6天内融合，因为此时抗体效价较高。
融合所有用到的实验材料和工具(剪过枪头和分装液体盒)进行高压灭菌，并对小鼠骨髓瘤细胞进行传代处理(要求传入新的培养瓶中，密度达到60-70%，并且选择不同的浓度梯度以确保第二天的融合时有最佳状态的细胞)。
融合操作步骤：实验前，将PEG和100ml R-1640培养液放入37℃水浴锅中孵育。
眼球采血处死小鼠（回收血液制备阳性血清用于下一步的ELISA筛选），75%的酒精浸泡消毒，取出小鼠股内侧沟淋巴结，随后把淋巴结放入4℃R-1640培养液（含2×双抗）（准备3个培养皿，一用来剪除淋巴结上的结缔和脂肪组织；二是用来清洗淋巴结；三是用来剪碎和撕碎淋巴结的，制备免疫小鼠的淋巴细胞）。
把含有淋巴细胞或脾细胞的悬液经过有棉花（好的脱脂棉）的吸管过滤，除去残渣，分离细胞。
过滤好的细胞2000r/min，10min。
制备足够多的骨髓瘤细胞（Ag8.8），1500r/min，10min，（每次用4℃R-1640培养液漂洗骨髓瘤细胞，洗3次以上，目的去除培养骨髓瘤细胞的培养液中的的血清，因为血清中的蛋白成分有抑制融合的作用）。
淋巴细胞和骨髓瘤细胞同时洗涤3次以上，要求2000r/min，10min，用10ml 4℃R-1640不完全培养液悬浮骨髓瘤细胞，第4次洗涤前全取淋巴细胞，按照淋巴细胞：骨髓瘤细胞=1：1的数量比（淋巴细胞：骨髓瘤细胞=1：5的体积比）取骨髓瘤细胞，将两种细胞混匀，加入37℃R-1640不完全培养液至50ml，2000r/min，5min，弃除上清液。
（注意：每次离心完毕要求尽量将上清液吸干净）加入预热的1ml PEG融合剂，加入过程中注意缓慢加入（速度：保持一滴一滴地滴入），并且边加边用吸管头轻轻拨动细胞团。
单克隆抗体制备实验报告
一、实验目的1. 了解单克隆抗体制备的基本原理和实验流程；2. 掌握单克隆抗体制备过程中各步骤的操作方法；3. 通过实验，获得特异性单克隆抗体。
二、实验原理单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
制备单克隆抗体的基本原理是杂交瘤技术，即将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而培养出单克隆细胞，最终获得单克隆抗体。
三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 细胞：SP2/0骨髓瘤细胞；3. 抗原：待筛选的抗原；4. 试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝佐剂、细胞培养液、抗生素、无菌操作器具等。
四、实验步骤1. 动物免疫（1）首免：将抗原与弗氏完全佐剂混合，通过多点注射法注射给Balb/c小鼠，剂量为150-200g/只。
（2）加强免疫：在首免后2-3周，重复首免过程。
2. B细胞提取（1）无菌操作，处死小鼠，取脾脏，制成单细胞悬液。
（2）用细胞分离液分离B细胞。
（3）洗涤、计数，调整细胞浓度。
3. 细胞融合（1）将B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合。
（2）将融合细胞在含有抗生素的细胞培养液中培养。
4. 杂交瘤细胞筛选（1）在培养液中加入抗原，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
（2）将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。
5. 单克隆抗体制备（1）将单克隆细胞在培养液中扩大培养，收集上清液。
（2）对上清液进行抗体检测，鉴定抗体特异性。
（3）采用适当方法纯化抗体，如亲和层析、离子交换层析等。
五、实验结果1. 成功获得特异性单克隆抗体。
2. 抗体特异性经ELISA等方法验证，与待筛选抗原具有高度特异性。
3. 抗体亲和力良好，可用于后续实验。
六、实验总结本次实验成功制备了特异性单克隆抗体，掌握了单克隆抗体制备的基本原理和实验流程。
在实验过程中，应注意以下几点：1. 动物免疫时，抗原与佐剂的混合比例、注射剂量、注射次数等要严格控制。
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单抗制备免疫
一、材料准备：
弗式完全佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）
弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）
实验动物：小鼠（Balb/c）雌性，8周以上,体重20g以上
每种抗原蛋白免疫小鼠4只
靶抗原：具有免疫原性的抗原或蛋白质、多肽，生理盐水
抗原要求：抗原要尽量在无毒无刺激溶液中（PBS或生理盐水），纯度大于80%，浓度1mg/ml以上，总量大于2mg。
抗原尽量是可溶性抗原，溶液为PBS，如必需加入刺激物质，SDS浓度在0.5%以下，尿素在2M以下，不含咪唑，丙烯酰胺等变性剂，要求溶液澄清，无沉淀。
二、实验步骤
1.抗原准备：每只小鼠按照100ug/100ul蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。
2.抗原-佐剂的准备：将抗原液与佐剂混合制成乳状液，抗原与佐剂混合按照1：1比例进行，加入搅拌子后于4度搅拌过夜。
注射量为200ul 每只小鼠，抗原量为100ug。
第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后加强使用弗氏不完全佐剂，最后一次加强不加佐剂，免疫前采集阴性血做为对照，乳化因考虑损失，多计算两只小鼠的量。
乳化完全判断标准：挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否
稳定，如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。
将乳状液移入1ml注射器。
3.小鼠免疫：将小鼠放在鼠笼上，拉住小鼠尾尖部，背部75%酒精消毒，针头15度角刺入小鼠皮下，挑起注射。
皮下注射共200ul，分5个点（背部皮下任意点）
4.冲击免疫：如计划在免疫3d后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原进行直接脾脏免疫。
过程：将小鼠在固定架上固定，脾脏位置毛剪掉并消毒，快速分别剪开外皮和内皮，将脾脏拉出，吸取100ul/100ug抗原注入脾脏内，并快速用手术线分别缝合内皮和外皮。
5.小鼠阳性血清采集：尾部剪尾采血20ul，用生理盐水稀释10倍，离心收集上清。
6.效价检测：间接法检测小鼠多抗血清效价。
包被：抗原使用PBS缓冲液，浓度1ug/1ml,每孔加入100ul溶液，4度包被过夜
酶：羊抗鼠IGG-HRP，1：5K
样品：20%小牛血清的PBS梯度稀释。