动物固体组织蛋白提取-Protocol

动物固体组织蛋白提取

1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较

快。

2、裂解液配制：：100：1，现配现用。（100010）。置入4℃冰上。

3、抽蛋白（应冰上进行）：

a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10管体系中加入：7-8粒磁珠、100组织、110、

1 。

b、匀浆。

手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

c、将组织匀浆转入1.5的管中（管、离心管）。12000 4°C 离心15。

d、离心后管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的管中。可-80℃保存。

4、蛋白浓度测定。

a、配工作液：溶液A：溶液50：1（200：4）。

*200；2*（1+1）*4。

需测试复孔。标本X，则需A

c、复孔，取蛋白6加入0.6管，再加入542O，混匀。即10倍稀释。

d、取20-25 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内，再加入200工作液，混匀振荡后，37℃30。

注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换，再加入工作液即起反应，应缩短时间。

e、酶标仪检测562吸光度。

f、计算蛋白浓度。

根据标准曲线，如 1.27450.1684 其中Y：蛋白浓度；X：吸光度。

最终蛋白浓度为：10*Y（、）

g、蛋白样本放-80℃冻存。

大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。

法（法）：

原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。

法：

原理：在碱性条件下，蛋白将还原为，与试剂形成紫色络合物，测定其在562处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

现对这两种方法进行比较：

一、实验材料：

细胞总蛋白提取试剂盒（0103）

M231

蛋白定量试剂盒（0146）

改良增强型蛋白质定量试剂盒（0145）

二、操作步骤：

法：

1.将冻干标准品（10支）用生理盐水或稀释成2000，1000 ,500 ,250 ,125 ,6

2.5 ,31.25 ,15.625 八个浓度的蛋白标准溶液。

2231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

3.各取20蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

4.滴加200考马斯增强型试剂（溶液A）至每孔混匀并充分震荡30S

5.停止震荡，在室温孵育样品10

6.在酶标仪中测量595时的吸光值。

7.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

法：

1.按50体积试剂A加入1倍体积试剂B配置适量工作液，充分混匀。

2.将冻干标准品（10支）用生理盐水或稀释成2000，1000 ,500 ,250 ,125 ,62.5 ,31.25 ,15.625 八个浓度的蛋白标准溶液。

3231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

4.各取20蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

5.滴加200工作液至每孔混匀并充分震荡30S

6.停止震荡，在37度孵育样品30

7.在酶标仪中测量562时的吸光值。

8.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

三、实验结果

其中1到8为2000，1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 的标准浓度的蛋白，9为空白孔，样品1为8倍稀释M231总蛋白，样品2为32倍稀释M231总蛋白

法：

为了测试准确，应在试剂加入后的5～20内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.4

法优点是：

1.灵敏度高，据估计比法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比法要大的多。

2.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

3.干扰物质少。如干扰法的、、2+离子、缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、100、十二烷基硫酸钠（）和0.1M的。（如同0.1M的酸干扰法一样）。

3. 标准曲线也有轻微的非线性，在0-1000浓度范围内有较好线性。因而不能用定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

法：

由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28

法特点：1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25μ，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的，5%的100，5%的20，