实验：非发酵菌的鉴定
非发酵菌的测定实验报告
一、实验目的1. 掌握非发酵菌的基本概念及分类；2. 熟悉非发酵菌的鉴定方法；3. 提高实验室操作技能，培养科学思维和严谨的工作态度。
二、实验原理非发酵菌是一类不发酵或不分解糖类的革兰氏阴性杆菌，主要包括假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属等。
非发酵菌的鉴定主要通过观察菌落特征、进行生化试验、动力与鞭毛观察等手段。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）非发酵菌菌种：假单胞菌、不动杆菌、产碱杆菌、莫拉菌、黄杆菌等；（2）培养基：普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、动力半固体培养基、氧化酶试验培养基等；（3）试剂：葡萄糖、乳糖、酵母提取物、酚红指示剂、氧化酶试剂等；（4）实验仪器：恒温培养箱、显微镜、酒精灯、无菌操作台等。
2. 实验仪器：（1）显微镜：用于观察菌落特征；（2）恒温培养箱：用于培养菌种；（3）酒精灯：用于无菌操作；（4）无菌操作台：用于无菌操作。
四、实验方法与步骤1. 菌落观察（1）将菌种接种于普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，分别于30℃、37℃培养24小时；（2）观察菌落特征，如菌落大小、形状、颜色、边缘、表面、透明度等；（3）记录观察结果。
2. 动力与鞭毛观察（1）将菌种接种于动力半固体培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种在半固体培养基中的生长情况，如是否有鞭毛、菌落是否呈指状、螺旋状等；（3）记录观察结果。
3. 氧化酶试验（1）将菌种接种于氧化酶试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生氧化酶，即菌落周围是否出现绿色；（3）记录观察结果。
4. 氧化-发酵（O/F）试验（1）将菌种接种于氧化-发酵试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生酸，即菌落周围是否出现红色；（3）记录观察结果。
5. 麦康凯琼脂平板生长情况（1）将菌种接种于麦康凯琼脂平板，30℃培养24小时；（2）观察菌种在麦康凯琼脂平板上的生长情况，如是否生长、生长速度等；（3）记录观察结果。
非发酵革兰阴性杆菌的检验 微生物实验
1、贝多芬的童年尽管如是悲惨，他对这个时代和消磨这时代的地方，永远保持着一种温柔而凄凉的回忆。
2、社会永远处在这两条路的中间：真理或爱。
它通常的解决，往往是把真理和爱两者一齐牺牲了。
3、脸上的肌肉突然隆起，血管膨胀、犷野的眼睛变得倍加可怕；嘴巴发抖；仿佛一个魔术家召来了妖魔而反被妖魔制服一般。
4、我的信仰使人厌恶或阻碍别人，这是可能的。
但要更改它却不在我能力范围以内，好似我不能改变我的**一样。
我除了我所相信的以外不能相信别的，尤其在这个我将回到神那边去的时候。
5、也许是他作品中最深刻的，仿佛用血泪写成的，结果是一文都不曾拿到。
把贝多芬煎熬完的是，日常的窘况，无穷尽的讼案：或是要人家履行津贴的诺言，或是为争取侄儿的监护权，因为他的兄弟卡尔于一八一五年死于肺病，遗下一个儿子。
6、我称为英雄的，并非以思想强力称雄的人，而只是靠心灵而伟大的人。
7、没有伟大的人格，就没有伟大的人，甚至也没有伟大的艺术家，伟大的行动者；所有的只是些空虚的偶像，匹配下贱的群众的；时间会把他们一齐摧毁。
成败又有什么相干？主要是成为伟大，而非显得伟大。
8、宽大的鼻子又短又方，竟是狮子的相貌。
一张细腻的嘴巴，但下唇常有比上唇前突的倾向。
牙床结实得厉害，似乎可以磕破核桃。
左边的下巴有一个深陷的小窝，使他的脸显得古怪地不对称。
9、艺术家对于他的作品的爱是艺术的心灵。
没有爱便没有艺术作品。
10、在这些**的痛苦之上，再加另外一种痛苦。
韦格勒说他从没见过贝多芬不抱着一股剧烈的热情。
这些爱情似乎永远是非常纯洁的。
11、他甚至在一八二六年时在自己头上打了一枪。
然而他并不死，倒是贝多芬几乎因之送命：他为这件事情所受的难堪，永远无法摆脱。
12、贝多芬的心灵里多少有些清教徒气息；粗野的谈吐与思想，他是厌恶的：他对于爱情的神圣抱着毫无假借的观念。
13、竭力为善，爱自由甚于一切，即使为了王座，也永勿欺妄真理。
14、有时候，人生的现象与痛苦是那么悲惨，对于我们的爱是一种打击，那时，为了拯救这爱，拯救这信念，我们不得不把它超临人世之上，以致它有和人世脱离一切关系的危险。
非发酵菌特征及鉴定思路课件
微生物质谱分析
利用质谱技术对微生物细胞壁进行分 析，获取菌株的分子量信息，进行鉴 定。
03
非发酵菌的鉴定步骤
菌落形态观察
观察菌落大小、形状、边缘、表面和透明度
非发酵菌的菌落形态多样，大小、形状、边缘、表面和透明度等特征有助于初步 鉴别。
观察菌落颜色
非发酵菌的菌落颜色多样，包括白色、黄色、橙色、红色等，不同颜色可能代表 不同的菌种。
确的分类和鉴定。
分类依据
根据基因序列相似性、进化关系 等因素，将非发酵菌分为不同的 分类单元，如属、种、亚种等。
分类标准
根据国际微生物分类学界的共识 和标准，结合形态学、生理生化 特征和分子生物学数据，确定非
发酵菌的分类地位。
系统发育分析
方法
通过构建系统发育树，分析非发酵菌在进化过程 中的位置和亲缘关系。
数据来源
利用多基因序列分析、宏基因组学等方法，获取 非发酵菌的系统发育数据。
树形结构
根据系统发育数据，绘制出非发酵菌的系统发育 树，明确各菌种之间的亲缘关系和进化路径。
05
非发酵菌的致病性与临床意义
非发酵菌的感染途径与症状
感染途径
非发酵菌主要通过呼吸道、皮肤或接 触等途径感染人体。
症状表现
非发酵菌感染的症状多样，常见的有 发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难等，严 重时可导致败血症、感染性休克等。
生化试验
通过测定菌株对不同碳源、 氮源的利用以及在特定环 境下的生长情况，了解菌 株的生理生化特性。
血清学试验
利用特异性抗体与抗原的 结合反应，对菌株进行特 异性鉴定。
分子生物学鉴定方法
16S rRNA基因测序
通过对菌株16S rRNA基因的测序，进行系统发育学分析，确定菌 株在分类学上的位置。
非发酵菌群的分类鉴定
• 该菌的生长特性、营养要求、及其它生物 学性状与铜绿假单胞菌极为相似，所不同 的是氧化酶阴性，这是与假单胞菌属相区 别的重要特性；此外，该菌一端具有3根以 上丛鞭毛，运动活泼，可与氧化酶阴性的 不动杆菌属和副百日咳鲍特氏菌相鉴别。
3、鼻疽（类鼻疽）伯克霍尔德菌
• 鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia mallei） 和类鼻疽伯克霍尔德菌（ Burkholderia pseudomallei）是鼻疽与类鼻疽的病原菌， 属假单胞菌属rRNA同源群的第二群；2000 年被NCCLS/CLSI（National Committee
脑膜炎败血黄杆菌在血琼脂平板和营养琼脂平板上的菌落特征（37℃，18—24h）
• 黄杆菌属目前共分为8个种和4个未命名 的生物群。它们分别是：
• 脑膜炎败血黄杆菌、芳香黄杆菌、短小黄 杆菌、水田黄杆菌、嗜醇黄杆菌、嗜糖黄 杆菌、嗜温黄杆菌、薮内黄杆菌及黄杆菌 Ⅱb、Ⅱe、Ⅱh、Ⅱi群。其中脑膜炎败血 黄杆菌、芳香黄杆菌、短小黄杆菌和黄杆 菌Ⅱb群可引起人类疾病。
支气管腐败 鲍特氏菌
+ — + +
+ +
鲍特氏菌属
鞭毛染色
脂、巧克力色血琼脂及兔血琼脂上均不能生长。
副百日咳鲍特氏菌和支气管腐败鲍特氏菌营养 要求不高，在上述培养基上均能生长。
• 3、该菌属细菌不分解糖类。其它生化反应见 下表。
鉴别要点
鞭毛 动力 37℃
18—24℃ 尿素酶 硝酸盐还原 氧化酶
百日咳 鲍特氏菌
— — — — —
+
副百日咳 鲍特氏菌
—
— — + — —
铜绿假单胞菌镜下形态和在血平板上的菌落特征
铜绿假单胞菌在普通琼脂培养基上的菌落特征
不发酵菌的生化鉴定
一、精氨酸鸟氨酸赖氨酸（1）氨基酸脱羧酶试验原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱，使培养基中的溴甲酚紫指示剂变紫色。
加石蜡油是为了造成一个厌氧环境．因为只有在厌氧环境下生成的胺才稳定．（2）培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基（对照培养基不加氨基酸）。
（3）方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油（氨基酸类反应要与空气隔绝），于35℃培养1～4d，每日观察结果（4）结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。
阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。
对照管应为黄色。
若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。
志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴制法除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。
L－氨基酸按0.5%加入，DL－氨基酸按1%加入。
再行校正pH至6.8。
对照培养基不加氨基酸。
分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。
试验方法：从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36±1℃培养18～24h，观察结果。
氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。
二、枸橼酸盐利用试验(1)原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。
(2)方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35℃孵育1~4d，逐日观察结果。
(3)结果：若用溴麝香草酚兰（ph6.0以下黄色，ph7.6以上蓝色）指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落生长，培养基绿色为阴性。
非发酵菌的检验(实验)
成都医学院 临床微生物学教研室
目的
❖ 1.掌握非发酵菌的形态、染色性和菌落特征。 ❖ 2.熟悉非发酵菌的主要生化反应。
器材
❖ 接种环、酒精灯、显微镜等
试剂
❖ 革兰染液、氧化酶试剂、非发酵菌编码生化 鉴定管及相关试剂、生理盐水等
标本
❖ 1#标本和2#标本
操作
❖ 1.标本涂片染色镜检 ❖ 2.接种、培养 ❖ 3.生化试验 ❖ （1）氧化酶试验 ❖ （2）非发酵菌编码生化鉴定管
1组 O-F试验 厌需 氧氧
01
2组 氧枸 麦 化橼 芽 酶酸 糖
42 1
3组 精甘木 氨露糖 酸醇
421
4组
硝D乙酸N酰盐 还Fra bibliotekA 酶
胺 酶
原
421
非发酵菌群的分类鉴定
产碱杆菌属
莫拉氏菌属
无色杆菌属
土壤杆菌属
黄色素
.
+
13
—
黄杆菌属
莫拉氏菌属
假单胞菌属 产碱杆菌属
无色杆菌属 土壤杆菌属
鞭毛染色
端毛菌
周毛菌
假单胞菌属
产碱杆菌属，无色杆菌属，土壤杆菌属
O型
O/F —
无色杆菌属，土壤杆菌属
还原硝酸盐后产气
+
—
产碱杆菌属
土壤杆菌属
无色杆菌属
.
14
第四节、非发酵菌群的属内鉴别
支气管败血鲍特氏菌，金氏杆菌属，无色杆菌属，
莫拉氏菌属，艾肯氏菌属，土壤杆菌属。
触酶
+
—
假单胞菌属，产碱杆菌属，黄杆菌属，
金氏杆菌属，
支气管败血鲍特氏菌，无色杆菌属，
艾肯氏菌属
莫拉氏菌属，土壤杆菌属
O/F
动力
弱F
—
37℃
18—24 ℃
金氏杆菌属
艾肯氏菌属
—
+
—
+
+
—
支气管败血 假单胞菌属
黄杆菌属
鲍特氏菌
.
20
铜绿假单胞菌鉴别要点：
（1）、铜绿假单胞菌在普通琼脂培养基上能 产生水溶性绿色素，使整个培养基变为绿色。
（2）、在血平板上经35—37℃，18—24h培 养可表现为：菌落灰绿色、半透明、大而扁 平、表面湿润、边缘不齐；有金属光泽；有 生姜样芳香气味；菌落周围有宽大的兰绿色 透明溶血环。
.
5
因此在临床上真正能分离出来且 有临床意义的非发酵菌群有：
假单胞菌属、寡氧单胞菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、 鲍特氏菌属（百日咳鲍特氏菌除外）、金氏杆菌属、不 动杆菌属、无色杆菌属、莫拉氏菌属、艾肯氏菌属、土 壤杆菌属。
实验九：非发酵菌
• 思考题：鞭毛染色法的原理？
小结
非发酵菌的鉴定要点，尤其是铜绿假单胞菌的鉴定。 1、培养特点及菌落特征：在普通琼脂平板上产生特征性的 蓝绿色水溶性绿脓素和黄绿色青脓素，血平板上形成大而 扁平，湿润，边缘不齐，有金属光泽，有生姜气味的灰绿 色菌落，并形成透明溶血环 最适生长温度35℃，4℃不生长，42℃可生长 2、95%以上的铜绿假单胞菌可通过观察以下几个特征而得 到鉴定： • 氧化酶阳性（10秒内）。 • 菌落较大，生姜样气味。 • 绿脓素产生。 • 少数铜绿假单胞菌可产生其他颜色色素，如红脓素（红 色），黑脓素（棕色到黑色），青脓素（黄色）。
非发酵菌生化编码鉴定管
• 原理：该系列鉴定共有9种生化培养基，共10项试验，参 照下述方法，将试验结果换算成4位数字，加以数值化后 查表。 • 例：某一分离菌株，具有下列鉴定结果，数值化后为1734， 查表得知：可能为施氏假单胞菌和洋葱单胞菌，再按表中 要求做硝酸盐产气补充实验区分。 • 1组 2组 3组 4组 O-F 氧化酶4分 精氨酸4分 硝还4分 厌氧2分 枸橼酸2分 甘露醇2分 DNA酶2分 需氧1分 麦芽糖1分 木糖1分 乙酰胺1分 结果：需氧 + + + - + + + - 得分： 1 7 3 4
实验九：非发酵菌
实验目的
• 掌握非发酵菌的基本特征和鉴定程序 • 掌握非发酵菌分类的鉴别试验
不发酵革兰阴性杆菌
• 假单胞菌属：铜绿假单胞菌 • 不动杆菌属：硝酸盐不动杆菌 • 产碱杆菌属：粪产碱杆菌
不发酵革兰阴性杆菌鉴定程序
• 见检验程序
实验内容
• 一、ＧＳ、氧化酶试验 • 二、接种非发酵菌生化编码鉴定管 • 三、鞭毛染色
微生物学--非发酵菌检验
（二）、微生物特性
❖ G-直或微弯曲杆菌，具有端鞭毛1-8根2根或 多根极端丛鞭毛，有动力，无芽孢。
❖ 该菌专性需氧，营养要求不高，可在普通平 板血平板和MAC上生长。血平板上培养1824小时，形成圆形、光滑、湿润、浅黄色菌 落；培养48小时菌落，可呈黄色、绿色或灰 白色，菌落中心可有变透明的趋势，称为“猫 眼”现象。
光滑、半透明、边缘整 齐不溶血的菌落。
（四）、微生物学检验
鉴定： ❖ 氧化酶阳性 ❖ 触酶阳性 ❖ 无动力 ❖ 不分解任何糖类 ❖ 吲哚试验阴性
（五）、药物敏感试验及结果解释
❖ 对青霉素类敏感 ❖ 对头孢类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖
甙类药物均为敏感 ❖ 脑炎或脑膜炎、脑脓肿应注意药物通过血
脑屏障的问题
（二）、临床意义
❖ 引起眼结膜炎、气管炎、肺炎、脑膜炎、 脑脓肿、心包炎、心内膜炎及泌尿生殖系 统炎症
（三）、微生物特性
❖ 革兰阴性球杆菌 ❖ 呈双短链状排列，
具有多形性
（四）、微生物学检验
分离培养： ❖ 营养要求较高 ❖ 生长温度32~35℃ ❖ 血琼脂平板上生长良好 ❖ 针尖大小的圆形凸起、
生物学特性
G-杆菌，无芽孢，无荚膜，多数菌有端鞭毛或 丛鞭毛，专性需氧菌，生长温度范围广，最适 30-37度，普通培养基上可以生长，可产各种水 溶性色素。抵抗力强，多种抗生素耐药。
微生物检验
2.鉴定：氧化分解葡萄糖、产酸不产气，触酶 氧化酶阳性，吲哚 、甲基红、VP阴性。
❖分型
1.噬菌体分型 2.血清分型 3.核糖体分型 4.PFGE分型
（二）、微生物检验
❖ 鉴定：氧化酶（-），明胶液化试验（+）， 七叶苷（+），赖氨酸脱羧酶（+）， 氧化分解葡萄糖。
非发酵菌及检验
3、检先增菌，再转 种血平板和麦康凯平板分离；脓汁、分泌物、 尿可直接种于上述培养基分离培养。
（3）鉴定：根据菌落特征、色素、 生姜气味、菌体形态、氧化酶试验等 作出鉴定。对无色素的菌株应与其他 假单胞菌鉴别。
铜绿假单胞菌的检验程序：
血液 体液
脑脊液、胸腹水、脓汁、痰、尿液 粪便
分离培养 血、麦康凯
增 菌 营养肉汤
直接涂片染色
分离培养 SS、麦康凯
初步鉴定 菌落特征，色 素 菌体形态、氧化酶
最后鉴定
生化反应
分型：血清学
噬菌体
铜绿假单胞菌的鉴定要点及与其他假单胞菌的区别
试 验 铜绿假 单胞菌 ＋ 荧光假 单胞菌 ＋ 恶臭假 单胞菌 ＋ 斯氏假 单胞菌 ＋ 嗜麦芽 假单胞 ＿ 鼻疽假 单胞菌 ＋/＿ 类鼻疽 假单胞 ＋
挑选可疑菌落
最后鉴定 生化反应
初步鉴定 KIA：底层、斜面不变 硝酸盐还原、氧化酶、 动力
不动杆菌属主要菌种生化反应特征
醋酸钙不 动杆菌 鲍曼不 动杆菌 溶血不 动杆菌 琼氏不 动杆菌 约翰逊 不动杆菌 洛菲不 动杆菌
葡萄糖氧化
木糖氧化 乳糖氧化 精氨酸双水解酶
＋
＿ ＋ ＋
＋
＋ ＋ ＋
+/_
+/_ ＿ ＋
琼氏不动杆菌
约翰逊不动杆菌
一、生物学性状
形态与染色 革兰阴性球杆菌，常成双排列， 不易退色，多数有荚膜、无芽孢、无鞭毛。 培养特性 专性需养，营养要求不高。
最适温度35℃ ，鲍曼不动杆菌42℃可生长。 血平板上 圆形凸起、2~3 mm ，光滑、边 缘整齐、灰白色的菌落，部分菌落呈黏液状（溶 血不动杆菌可形成 β -溶血环）； 不产生色素。 麦康凯平板 形成粉红色菌落。
微生物学检验非发酵菌及检验
铜绿假单胞菌 不动杆菌属 产碱杆菌属 莫拉菌属 黄杆菌属 金氏杆菌属 土壤杆菌属等
非发酵菌主要特点
氧化酶：＋；不动杆菌属除外 O/F试验：O/－ 动力试验：多数有鞭毛，但半固体动力 试验不明显，常采用镜检或鞭毛染色
葡萄糖氧化发酵试验（O/F）
O/F培养基 （半固体高层）
O/F：O
革兰阴性杆菌 氧化酶＋ O/F： － 硝酸盐还原－；亚硝酸盐还原＋ KIA：底层斜面不变色 注意与不动杆菌鉴别
不动杆菌属－－主要特征
现已命名6个生物种，代表菌为醋酸钙不 动杆菌 革兰阴性球杆菌，成双排列，无鞭毛， 动力阴性 专性需氧，营养要求不高，普通平板、 Mac平板上可生长 氧化酶－；O/F：O／－；硝酸盐还原－ 临床标本分离率仅次于铜绿假单胞菌 检验程序
指示剂：溴麝香草酚蓝 培养基pH：
O/F：F
葡萄糖氧化发酵试验（O/F） O/OF：/F：O F O/F：－
肠道杆菌、非发酵菌、弧菌科鉴别
鉴定试验 肠杆菌科 非发酵菌 弧菌科
氧化酶
－
＋
＋
葡萄糖氧化/ 发酵（O/F）
鞭毛
F 周鞭毛
O／－
F
单、丛、周 单、丛
假单胞菌属
假单胞菌科细菌根据rRNA-DNA同源性 分为5群，其中Ⅰ群属于假单胞菌属，共 7种细菌，代表菌种为铜绿假单胞菌。 多为条件致病菌，是医院感染的主要病 原菌
假单胞菌属共同点
革兰阴性杆菌，无芽孢、无荚膜，单或 丛鞭毛 专性需氧 营养要求不高 氧化酶：＋ O/F：O Mac生长：＋ 产生水溶性色素
铜绿假单胞菌－－形态染色
革兰阴性杆菌，无芽孢、无荚膜，单 或丛鞭毛
铜绿假单胞菌－－培养特性
专性需氧、营养要求不高 最适温度35℃，42 ℃ 生长，4℃不生长 产生荧光素和蓝绿色水溶性的绿脓素， 培养物呈蓝绿色。 培养物有生姜气味
非发酵菌的培养与鉴定
铜绿假单胞菌在血平板上的菌落形态
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)
3.粗糙型：菌落呈纽扣状，表面 粗糙或菌落中央隆起边缘扁平。
铜绿假单胞菌在血平板和巧克力平板上的菌落形态
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)
4.粘液型：菌落光滑，隆起，呈黏液 状，嵌入培养基中，不易挑起，似肺炎克 雷伯菌菌落，但菌落呈无色半透明。
结果判读：出现红色为 阳性，不变色为阴性。
氧化酶阳性
非发酵菌生化鉴定反应共选“套餐”
各生化管阴阳性结果的判读
斜面产碱，底层不变 H2S阴性K/K，H2S-
斜面产酸，底层产酸 斜面产碱，气体阴性，
产气， H2S阴性（A/A, H2S阳性（K/A,气体
气体+，H2S-）
+，H2S+）
动力实验 左管阳性，右管阴性
嗜血杆菌鉴定实验：“卫星现象”
原理：嗜血杆菌生长需要Ⅴ因子和（或）Ⅹ因子，血平 板中红细胞本身含这两种因子，Ⅹ因子溶血后可直接 释放，Ⅴ因子会被溶血时释放的NAD酶水解，而金 黄色葡萄球菌等在生长中能产生Ⅴ因子，因此，将这 两种细菌共培养时，释放或产生的因子可以促进嗜血 杆菌的生长，从而出现靠近金黄色葡萄球菌周围环绕 较大的嗜血杆菌菌落。该现象称之为卫星现象。
非发酵菌和嗜血杆菌的培养和鉴定
苏州大学附属第二医院 微生物室 周惠琴
非发酵菌和嗜血杆菌的培养和鉴定
1 实验目的 2 实验内容 3 操作步骤 4 结果观察
一.实验目的
1.掌握常见非发酵菌的菌落特点、染色形 态及生化反应鉴定实验。
2.掌握嗜血杆菌属的菌落特点及鉴定实验。
二.实验内容
非发酵菌的鉴定
非发酵菌的鉴定定义：非发酵菌（nonfermenters）指一群需氧或兼性厌氧、不发酵糖类，能在普通培养基上生长的革兰阴性杆菌。
主要存在外界环境中，种类繁多，多为条件致病菌或医院内感染菌。
关于临床标本中NFB的意义，在混合培养物中见到时，必须考虑到患者的情况和标本来源。
一般来说，以纯培养方式分离自正常无菌部位的NFB，一定要鉴定到种并进行抗生素敏感性试验。
目前CLSI中，K-B法除了假单胞菌属、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌有抗生素敏感性实验的判断标准外，其他非发酵菌没有K-B法的标准。
一、鉴定原则：1．血、无菌部位（脑脊液、胸水等），特殊病人，少见菌可用API-20NE或VIKET TWO-GN 卡鉴定。
2．其它部位如呼吸道标本、临床常见的非发酵，根据菌落形态、生化反应、抗生素耐药谱等综合分析手工法鉴定即可。
二、非发酵性菌基本分类：假单胞菌属Pseudomonas spp.（20多个临床上重要菌种中，铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌等最常见。
）不动杆菌属Acinetoacter spp.（最常分离的种鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌、溶血不动杆菌等）窄食单胞菌Stenotrophomonas spp.（嗜麦芽窄食单胞菌、非洲嗜麦芽窄食单胞菌）伯克霍尔德菌Burkholderia spp.（洋葱伯克霍尔德菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌等）鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas spp.（少动鞘氨醇杆菌）无色杆菌属Achromobacter spp.（木糖氧化无色杆菌）希瓦氏菌属Shewanella spp. （腐败希瓦氏菌海藻希瓦氏菌）产硷菌属Alcaligenes spp.黄杆菌属Flavoacterium spp.莫拉菌属Moraxella spp.罗尔斯通菌属 Ralstonia spp.食酸菌属Acidovorax spp.丛毛单胞菌属Comamonas spp.甲基杆菌属Methylobacterium spp.等还有一些未定名的菌群三、辨认非发酵菌的基本要点1. 分离培养基上的菌落有以下情况初步考虑非发酵菌的存在a.培养基上生长较差或中国蓝上不生长的阴性菌。
实验：非发酵菌的鉴定
＋/－ ＋
嗜麦芽窄食单胞菌
氧化酶 动力 明胶 42ﾟC 42ﾟ 七叶苷 赖氨酸 – + + +/+/+ +
方法： 方法：
1.形态观察； 1.形态观察； 2.菌落观察； 2.菌落观察； 3.生化反应。 3.生化反应。
常见非发酵菌的鉴定依据 1.铜绿假单胞菌： 1.铜绿假单胞菌：
单端鞭毛（三根以下） 单端鞭毛（三根以下） 动 力 氧化分解（O-F培养基） 培养基） 氧化分解（ 葡萄糖 乳糖、蔗糖 乳糖、 木 糖 氧化酶 赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶 鸟氨酸脱羧酶 H2S产生 在42℃ 生长 42℃ ＋ － ＋/－ ＋ － ＋ － － ＋ 98 0 85 100 0 99 0 0 100 ＋ ＋ 97 97
不动杆菌属主要菌种间的鉴别
醋酸钙 葡萄糖氧化 木糖氧化 乳糖氧化 精氨酸双水解酶 鸟氨酸脱羧酶 枸椽酸盐利用 明胶液化 生长温度: 37℃ 生长温度: 37℃ 41℃ 41℃ 42℃ 42℃ + － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ － － 鲍曼 + ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ 溶血 琼氏 约翰逊 洛菲 － － ＋ －/＋ － － － － － － － ＋ － － － － ＋ － － +/－ － +/－ +/－ － +/－ － ＋ － ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ － － ＋ ＋ －
实酵菌的形态、染色特性、生 1.掌握常见非发酵菌的形态、染色特性、生 化反应及鉴定依据； 2.熟悉常见的几种非发酵菌的鉴定程序及鉴 2.熟悉常见的几种非发酵菌的鉴定程序及鉴 别方法。
器材和试剂
1.菌种：假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌 1.菌种：假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌 和窄食单胞菌属细菌； 2.鉴定试验：葡萄糖OF管，枸椽酸盐琼脂， 2.鉴定试验：葡萄糖OF管，枸椽酸盐琼脂， 尿素，鸟氨酸、精氨酸、赖氨酸，明胶、 七叶苷，DNA酶，硝酸盐，木糖，乳糖， 七叶苷，DNA酶，硝酸盐，木糖，乳糖， 蔗糖。
每日一菌之非发酵菌及检验
每日一菌之非发酵菌及检验一、概述非发酵菌主要是指一群①不发酵或不分解糖类的②革兰阴性③无芽胞④需氧杆菌。
目前，非发酵菌包括13个属。
主要有假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属等。
这些细菌大多为条件致病菌。
对于非发酵菌的鉴定，必须首先进行种属间的鉴别，然后进行种间的鉴定。
一般实验室只需用几项试验，如氧化酶、O-F试验、动力及鞭毛、菌落色素、硝酸盐还原试验以及在麦康凯琼脂上的生长情况等即可对90%～95%分离的菌株作出初步鉴定。
1.培养温度：多数非发酵菌适宜生存于自然界，培养温度以30℃为宜。
有的更适宜生长于室温（18℃～22℃）。
故常规标本应先培养于35℃～37℃，再培养于30℃或室温。
2.动力与鞭毛：在非发酵菌的鉴定中，细菌是否具有鞭毛及鞭毛的特点有重要的诊断意义。
由于非发酵菌大部分为专性需氧菌，在半固体培养基上观察动力不明显，因细菌在琼脂表面生长，底层穿刺生长不良或不生长，故观察非发酵菌的动力以30℃或室温12～24h培养物悬滴法为准。
有时需借助鞭毛染色予以鉴定。
3.氧化酶试验：该试验是鉴定非发酵菌的重要试验，非发酵菌中除不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及个别假单胞菌外，氧化酶试验均为阳性。
4.氧化-发酵（O-F）试验：本试验是确定非发酵菌与发酵菌以及测定非发酵菌是否利用糖的基本试验。
非发酵菌对葡萄糖的代谢特点是氧化型产生微量酸。
在氧化-发酵（O-F）试验中，应为开管产酸，闭管不变。
5.在麦康凯琼脂上生长情况：如假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属等生长，而莫拉菌属和艾肯菌属等不生长。
非发酵菌几种主要菌属的基本特征见表5-25-1。
表5-25-1 非发醇菌主要菌属的基本特征二、假单胞菌属假单胞菌属为一大组革兰阴性杆菌，大量存在于水、土壤和空气中。
在人类感染的非发酵菌中，假单胞菌属约占70%～80%，主要为铜绿假单胞菌（约55%～65%）。
其次为嗜麦芽窄食单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、产碱假单胞菌等。
微生物学检验非发酵菌及检验
涂片 染色镜检
标本
分离培养 （血平板、麦康凯）
可疑菌落
血标本 增菌
涂片 动力观察 革兰染色 鞭毛染色
氧化酶
O/F 硝酸盐还原
KIA斜面底层不变色 其他生化反应
测验1
关于铜绿假单胞菌，错误的是 A 革兰阴性杆菌 B 氧化酶－、触酶－ C 硝酸盐还原－ D 产生水溶性蓝绿色素 E 菌落有金属光泽
测验2
黄杆菌科
革兰阴性杆菌，无鞭毛 专性需氧、营养要求不高，普通平板上 生长，形成黄色色素 麦康凯平板上不生长 氧化酶＋ O/F：O
莫拉菌属
革兰阴性球杆菌 ，不易脱色，成双排列 （与奈瑟菌相似），无鞭毛，部分菌株 有荚膜 专性需氧，营养要求高，普通平板上不 生长 氧化酶＋ O/F：－
非发酵菌－－检验程序
流感嗜血杆菌与金 黄色葡萄球菌在血 平板上共同孵育时， 由于后者能合成较 多的V因子，在金黄 色葡萄球菌菌落周 围生长的流感嗜血 杆菌的菌落较大， 离金黄色葡萄球菌 菌落越远的越小。
卫星现象
根据荚膜抗原分ABCDEF六型，B型 毒力最强
可产生自溶酶
致病物质：荚膜、菌毛、内毒素、 IgA蛋 白酶
所致疾病
军团菌
是引起军团菌病的病原体 首发于1976年的美国一次军人聚会，故 称作军团病 1982年,在我国南京首次证实了军团菌病。
形态染色
革兰阴性，但不易被着色 杆菌，形态有多形性 Gimenen染色，菌体呈红色，背景为绿 色 不形成芽孢，无荚膜 ， 有端生或侧生鞭毛
培养特性
营养要求高 专性需氧 需～5％CO2 生长缓慢 常用培养基及菌落特征 BCYE培养基：灰白色、圆形光滑湿润菌落 F-G培养基：针尖大小、黄色荧光
铜绿假单胞菌－－分型检查
非发酵菌检验程序(详细版)
非发酵菌是一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、条件致病菌。
【氧化酶试验】铜绿、粪产碱为阳性，醋酸钙不动杆菌为阴性【非发酵菌生化编码管鉴定】原理：该系列鉴定共有9种生化培养基，共10项试验，参照下述方法，将试验结果换算成4位数字, 加以数值化后查表。
例：某一分离菌株，具有下列鉴定结果，数值化后为1734，查表得知：可能为施氏假单胞菌和洋葱单胞菌，再按表中要求做硝酸盐产气补充实验区分。
无芽胞的革兰阴性杆菌；多为- 4组0-F厌顿2分需氧1分结果：需氧得分匸12组氧化輕分枸携酸2分麦芽犍1分+ + +73纠精氨就4分甘露醇2分木糖1分-+ +4组硝还4分DNA酶2分乙酰胺4分观察结果时按表中说明进行。
—、O-F试验接种2支编码管，1支加无菌石蜡油，另1支不加。
原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。
本试验又称氧化发酵（0/F或Hugh —Leifson , HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；培养基表面和底部都产酸（变黄）为发酵型；培养基表面变为深蓝色为产碱型；培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。
二、硝酸盐还原试验原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐，生成亚硝酸盐和氮气等。
硝还试验是测定还原过程中生成的亚硝酸盐。
如培养基中有亚硝酸盐存在，则亚硝酸盐与醋酸生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸，后者与a -萘胺结合成N- a -萘胺偶氮苯磺酸。
假单胞菌等能使硝酸或亚硝酸盐还原为氮气，此为脱硝化或脱氮化作用。
结果解释：/变红一®性沿试验管加AB液各少许变一加锌粉-不变r阳性，产气\变红阴性注意事项：若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否已被还原，可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色，表示硝酸盐仍然存在；若不出现红色，表示硝酸盐已衩还原为氨和氮。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
－
－ ＋
0
0 100
不动杆菌属主要菌种间的鉴别
醋酸钙 葡萄糖氧化 木糖氧化 乳糖氧化 精氨酸双水解酶 + － ＋ ＋ 鲍曼 + ＋ ＋ ＋ 溶血 琼氏 约翰逊 洛菲 － － ＋ －/＋ － － ＋ － +/－ － +/－ － － ＋ ＋ ＋
鸟氨酸脱羧酶
枸椽酸盐利用 明胶液化 生长温度: 37℃ 41℃ 42℃
实验：非发酵菌的鉴定
实验目的
1.掌握常见非发酵菌的形态、染色特性、生 化反应及鉴定依据； 2.熟悉常见的几种非发酵菌的鉴定程序及鉴 别方法。
器材和试剂
1.菌种：假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌 和窄食单胞菌属细菌； 2.鉴定试验：双糖管，葡萄糖OF管，枸椽 酸盐琼脂，尿素，鸟氨酸、精氨酸、赖氨 酸，明胶、七叶苷，DNA酶，硝酸盐，木 糖，乳糖，蔗糖。
方法：
1.形态观察； 2.菌落观察； 3.生化反应。
常见非发酵菌的鉴定依据
1.铜绿假单胞菌：
＋ ＋ ＋ － ＋/－ 97 97 98 0 85
单端鞭毛（三根以下） 动 力 氧化分解（O-F培养基） 葡萄糖 乳糖、蔗糖 木 糖
氧化酶
赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶
＋
－ ＋
100
0 99
鸟氨酸脱羧酶
＋
＋ － ＋ － －
＋
＋ － ＋ ＋ ＋
－
＋ ＋ ＋ － －
－
－ ＋ ＋ －
－
－ － － －
－
－ － ＋ － －
＋/－ ＋
嗜麦芽窄食单胞菌
氧化酶 动力 明胶 42ﾟC 七叶苷 赖氨酸 – + + +/+ +
பைடு நூலகம்