非发酵菌的检验(实验)
dl第二十一章 非发酵菌及检验
分离培养
BAP、SS、MAC
鉴定
初步鉴定（菌落、菌体特征，色素、氧化酶、 KIA），最后鉴定（系统生化、血清学）
药敏试验
粪便
胸腹水 离心 脑脊液 沉淀 尿液 分泌物 血液 （增菌） 体液
分离培养 （SS、MAC）
可 疑 菌 落 初 步 鉴 定
不动杆菌属
不动杆菌属（Acinetobater）为一群不发酵
糖类、氧化酶 - 、无动力的革兰阴性杆菌。 生化反应：氧化酶 - ，MIU - - - ，硝酸盐 还原试验 - 。 耐药性：对全部氨基青霉素、一代二代头 孢菌素和一代喹诺酮类抗生素天然耐药。
鲍曼不动杆菌在BAP上的生长现象
4 2 1
O-F
1
DNA
结果 总值
O
+ + — 6
+ — + 5
+ — — 4
鉴定值：1654
鉴定结果：铜绿假单胞菌
嗜麦芽窄食假单胞菌
嗜麦芽窄食假单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）为条件致病菌，常引起抵抗力
低下患者的各种感染，在假单胞菌的感染 中检出率仅次于铜绿假单胞菌。 生化反应特殊：氧化酶 - ；赖氨酸脱羧酶 +； 氧化分解麦芽糖；水解七叶苷。 耐药性：含有-内酰氨酶，对亚胺培南天然 耐药，临床治疗首选磺胺类（TMP/SMZ）； 喹诺酮类：环丙沙星或替卡西林/克拉维酸。
铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）是假单胞
菌属的代表菌种，为条件致病菌，是医院 感染的主要病原菌。可经多种感染途径、 污染导致多种感染，且对多种抗生素天然 耐药，因此有很重要的临床意义。
临床检验技师-微生物检验(2019)讲义第二十章_不发酵菌及检验
第二十章不发酵菌及检验（不发酵G-杆菌）本章内容概述假单胞菌属（一）铜绿假单胞菌（二）嗜麦芽窄食单胞菌不动杆菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、莫拉菌属军团菌属不发酵菌概述不发酵或仅氧化形式利用葡萄糖的革兰阴性无芽胞杆菌；大部分为专性需氧菌。
包括13个属。
大多为条件致病菌。
除不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及个别假单胞菌外，氧化酶试验均为阳性。
氧化-发酵（O-F）试验是确定非发酵菌与发酵菌以及测定非发酵菌是否利用糖的基本试验。
麦康凯琼脂上：假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属等生长，而莫拉菌属和艾肯菌属等不生长。
假单胞菌属铜绿假单胞菌——生物学特性形态与结构形态：细长杆菌。
染色：G-。
特殊结构：无芽胞，无荚膜。
有1～3根鞭毛，运动活泼。
培养特性营养要求：不高。
气体环境：专性需氧。
温度环境：最适35℃，4℃不生长。
菌落特点：普通琼脂平板：圆形大小不一，边缘不整齐、扁平、隆起、光滑湿润且常呈融合状态的菌落。
血液琼脂平板：扁平、湿润、有特殊气味的灰绿色或蓝绿色菌落，有金属光泽；周围有透明溶血环。
选择培养基：（麦康凯琼脂培养基）微小无光泽半透明菌落，48h菌落中心常呈棕绿色。
（SS琼脂培养基）类似沙门菌的菌落，稍久菌落可呈棕绿色。
产生的主要色素：①绿脓素，为蓝绿色，无荧光性；②绿色荧光素。
铜绿假单胞菌——微生物检验及鉴定标本采集：根据病情采集相应的临床标本。
形态学检查分离培养：依据菌落特征、色素（约10%菌株不产生色素）、气味等以及涂片染色结果。
生化试验（鉴定）耐药性具有多重耐药。
初代敏感的菌株在治疗3～4d后可能发生耐药。
亚胺培南耐药主要原因之一是产生金属酶。
铜绿假单胞菌——致病性及临床意义俗称绿脓杆菌。
是医院感染的主要病原体之一。
引起的局部感染常见于烧伤或创伤后，亦可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎和下呼吸道感染，甚至引起心内膜炎、肺炎，严重者可引起败血症，死亡率甚高。
假单胞菌属嗜麦芽窄食单胞菌革兰阴性杆菌。
端鞭毛1～8根，有动力、无芽胞、无荚膜。
非发酵菌的测定实验报告
一、实验目的1. 掌握非发酵菌的基本概念及分类；2. 熟悉非发酵菌的鉴定方法；3. 提高实验室操作技能，培养科学思维和严谨的工作态度。
二、实验原理非发酵菌是一类不发酵或不分解糖类的革兰氏阴性杆菌，主要包括假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属等。
非发酵菌的鉴定主要通过观察菌落特征、进行生化试验、动力与鞭毛观察等手段。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）非发酵菌菌种：假单胞菌、不动杆菌、产碱杆菌、莫拉菌、黄杆菌等；（2）培养基：普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、动力半固体培养基、氧化酶试验培养基等；（3）试剂：葡萄糖、乳糖、酵母提取物、酚红指示剂、氧化酶试剂等；（4）实验仪器：恒温培养箱、显微镜、酒精灯、无菌操作台等。
2. 实验仪器：（1）显微镜：用于观察菌落特征；（2）恒温培养箱：用于培养菌种；（3）酒精灯：用于无菌操作；（4）无菌操作台：用于无菌操作。
四、实验方法与步骤1. 菌落观察（1）将菌种接种于普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，分别于30℃、37℃培养24小时；（2）观察菌落特征，如菌落大小、形状、颜色、边缘、表面、透明度等；（3）记录观察结果。
2. 动力与鞭毛观察（1）将菌种接种于动力半固体培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种在半固体培养基中的生长情况，如是否有鞭毛、菌落是否呈指状、螺旋状等；（3）记录观察结果。
3. 氧化酶试验（1）将菌种接种于氧化酶试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生氧化酶，即菌落周围是否出现绿色；（3）记录观察结果。
4. 氧化-发酵（O/F）试验（1）将菌种接种于氧化-发酵试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生酸，即菌落周围是否出现红色；（3）记录观察结果。
5. 麦康凯琼脂平板生长情况（1）将菌种接种于麦康凯琼脂平板，30℃培养24小时；（2）观察菌种在麦康凯琼脂平板上的生长情况，如是否生长、生长速度等；（3）记录观察结果。
非发酵菌及检验
窄食单胞菌属(Stenotrophmonas) 土壤杆菌属
丛毛单胞菌属(Comamonas)
金氏杆菌属(Kingella) 食酸菌属（Acidovorax）
莫拉菌属(Moraxella)
鉴定系统
非发酵菌生化鉴定系统
假单胞菌属
(Pseudomonas)
一、分类 P335
假单胞菌属包括200多个菌种，尤以铜绿假单 胞菌（P.aeruginosa）多见。 恶臭假单胞菌生物变种(P.putica biovars)
• 非发酵革兰阴性菌（非发酵菌）的概念、
二、细菌特性
1. 形态染色
革兰阴性杆菌， 多为球杆状，单个存
在或成双排列，无芽
胞，无鞭毛，粘液型
菌株有荚膜。
2. 培养特性
专性需氧，营养要求不高，最 适生长温度为37℃，但有些 菌株可在42℃生长。 血琼脂平板：菌落圆形、光滑、 边缘整齐、灰白色，多数菌 株不溶血，有些β溶血。
麦康凯琼脂平板：菌落呈粉红 色，但在SS琼脂培养基上只 有部分菌株生长。
四、微生物学检验
胸水、血液 血清间接荧光 抗体染色、 ELISA等 气管分泌物和肺、肝、脾组织 分离培养 BCYE或BCYE＋抗生素 血琼脂平板、巧克力琼脂平板 35℃ 2.5%CO2 24h生长 （非军团菌） 48h后生长 革兰染色 姬美耐染色 革兰阴性菌 革兰阳性菌 非军团菌 直接荧光抗体 PCR、DNA探针 双相培养基 BCYE 增菌培养
3. 生化反应
氧化酶－
O/F试验为氧化型（O）
硝酸盐还原试验－
三、临床意义
条件致病菌，医院感染的常见病
原菌。
可从各种临床标本如血液、尿液、
脓液、呼吸道分泌物及脑脊液等
非发酵菌 微生物学检验
非发酵G-杆菌(nonfermentative G- Bacilli)1. 非发酵菌是一群需氧、无芽孢、不利用糖或仅能氧化分解糖类是做为能量来源的G-杆菌。
（1）通常所讲的非发酵菌指在KIA中24小时内表面能够生长，在底部不生长的需氧G-杆菌。
（2）非发酵菌与其它苛养或非糖发酵的G-杆菌之间的界限只是传统意义上的，并不是根据明确的遗传或表型特点来划分。
（3）多为条件致病菌，近年来日益增多，尤其是医院感染。
2. 分类与命名：主要的非发酵G-杆菌属被分成6个科：（1）假单胞菌科：根据rRNA-DNA同源性分为5个rRNA群①rRNAⅠ群/假单胞菌属；②rRNAⅡ群/伯克霍尔德菌属；③rRNAⅢ群/丛毛单胞菌属、食酸菌属；④rRNAⅣ群/短波毛单胞菌属；⑤rRNAⅤ群/窄食单胞菌属；⑥其它：鞘氨醇单胞菌属、希瓦菌属等（2）产碱杆菌科：产碱杆菌属；（3）黄杆菌科：华丽杆菌属（4）莫拉菌科：不动杆菌属、莫拉菌属；（5）甲基球菌科；（6）根瘤菌科3. 非发酵菌的基本鉴定要求（1）缺少糖发酵的证据，通常是在KIA或TSI培养基中无酸产生，斜面和底部均呈红色。
（2）氧化酶+（不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、唐菖蒲伯克菌、浅黄华丽单胞菌、栖稻黄素单胞菌-），但并非所有氧化酶+的G-杆菌都是非发酵菌。
（3）麦康凯上生长很差或不生长。
（4）动力：多为+，但多为专性需氧，故半固体培养基中不明显，宜用直接动力观察或染色法。
4. 重要的鉴定试验（1）葡萄糖利用（O/F试验）：O/F培养基:蛋白胨和糖类的比例为1:5而不同于发酵菌的1:2。
（2）氧化酶试验：（3）动力：半固体培养基:应只穿刺培养基顶部4mm，在培养4-6小时后首次观察结果,24和48小时后再次观察结果。
更准确的方法是湿片法和鞭毛染色。
（4）色素形成：非发酵菌可形成多种色素，有助于菌种的鉴定。
（5）硝酸盐还原/产气：将硝酸盐还原成亚硝酸盐，进而释放氮的生化过程。
（6）吲哚试验：需用含色氨酸丰富的培养基，产吲哚黄杆菌、脑膜败血黄杆菌、食酸丛毛单胞菌等+。
实验：非发酵菌的鉴定
－
－ ＋
0
0 100
不动杆菌属主要菌种间的鉴别
醋酸钙 葡萄糖氧化 木糖氧化 乳糖氧化 精氨酸双水解酶 + － ＋ ＋ 鲍曼 + ＋ ＋ ＋ 溶血 琼氏 约翰逊 洛菲 － － ＋ －/＋ － － ＋ － +/－ － +/－ － － ＋ ＋ ＋
鸟氨酸脱羧酶
枸椽酸盐利用 明胶液化 生长温度: 37℃ 41℃ 42℃
实验：非发酵菌的鉴定
实验目的
1.掌握常见非发酵菌的形态、染色特性、生 化反应及鉴定依据； 2.熟悉常见的几种非发酵菌的鉴定程序及鉴 别方法。
器材和试剂
1.菌种：假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌 和窄食单胞菌属细菌； 2.鉴定试验：双糖管，葡萄糖OF管，枸椽 酸盐琼脂，尿素，鸟氨酸、精氨酸、赖氨 酸，明胶、七叶苷，DNA酶，硝酸盐，木 糖，乳糖，蔗糖。
方法：
1.形态观察； 2.菌落观察； 3.生化反应。
常见非发酵菌的鉴定依据
1.铜绿假单胞菌：
＋ ＋ ＋ － ＋/－ 97 97 98 0 85
单端鞭毛（三根以下） 动 力 氧化分解（O-F培养基） 葡萄糖 乳糖、蔗糖 木 糖
氧化酶
赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶
＋
－ ＋
100
0 99
鸟氨酸脱羧酶
＋
＋ － ＋ － －
＋
＋ － ＋ ＋ ＋
－
＋ ＋ ＋ － －
－
－ ＋ ＋ －
－
－ － － －
－
－ － ＋ － －
＋/－ ＋
嗜麦芽窄食单胞菌
氧化酶 动力 明胶 42ﾟC 七叶苷 赖氨酸 – + + +/+ +
微生物学--非发酵菌检验
（二）、微生物特性
❖ G-直或微弯曲杆菌，具有端鞭毛1-8根2根或 多根极端丛鞭毛，有动力，无芽孢。
❖ 该菌专性需氧，营养要求不高，可在普通平 板血平板和MAC上生长。血平板上培养1824小时，形成圆形、光滑、湿润、浅黄色菌 落；培养48小时菌落，可呈黄色、绿色或灰 白色，菌落中心可有变透明的趋势，称为“猫 眼”现象。
光滑、半透明、边缘整 齐不溶血的菌落。
（四）、微生物学检验
鉴定： ❖ 氧化酶阳性 ❖ 触酶阳性 ❖ 无动力 ❖ 不分解任何糖类 ❖ 吲哚试验阴性
（五）、药物敏感试验及结果解释
❖ 对青霉素类敏感 ❖ 对头孢类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖
甙类药物均为敏感 ❖ 脑炎或脑膜炎、脑脓肿应注意药物通过血
脑屏障的问题
（二）、临床意义
❖ 引起眼结膜炎、气管炎、肺炎、脑膜炎、 脑脓肿、心包炎、心内膜炎及泌尿生殖系 统炎症
（三）、微生物特性
❖ 革兰阴性球杆菌 ❖ 呈双短链状排列，
具有多形性
（四）、微生物学检验
分离培养： ❖ 营养要求较高 ❖ 生长温度32~35℃ ❖ 血琼脂平板上生长良好 ❖ 针尖大小的圆形凸起、
生物学特性
G-杆菌，无芽孢，无荚膜，多数菌有端鞭毛或 丛鞭毛，专性需氧菌，生长温度范围广，最适 30-37度，普通培养基上可以生长，可产各种水 溶性色素。抵抗力强，多种抗生素耐药。
微生物检验
2.鉴定：氧化分解葡萄糖、产酸不产气，触酶 氧化酶阳性，吲哚 、甲基红、VP阴性。
❖分型
1.噬菌体分型 2.血清分型 3.核糖体分型 4.PFGE分型
（二）、微生物检验
❖ 鉴定：氧化酶（-），明胶液化试验（+）， 七叶苷（+），赖氨酸脱羧酶（+）， 氧化分解葡萄糖。
非发酵菌群的分类鉴定
假单胞菌属 产碱杆菌属 无色杆菌属 土壤杆菌属 端毛菌 假单胞菌属 鞭毛染色 周毛菌 产碱杆菌属，无色杆菌属，土壤杆菌属 O/F O型 无色杆菌属，土壤杆菌属 还原硝酸盐后产气 + — 土壤杆菌属 无色杆菌属 — 产碱杆菌属
第四节、非发酵菌群的属内鉴别
一、假单胞菌属和 寡氧单胞菌属
假单胞菌属属假单胞菌科，该属为严格的专性需 氧的革兰氏阴性杆菌，具有一端鞭毛，无荚膜、 无芽孢。该菌属在自然界中分布广泛，营养要求 不高，氧化酶试验均为阳性，是假单胞菌科的代 表菌属。
氧化酶阴性菌群
不动杆菌属，寡氧单胞菌属，付百日咳鲍特氏菌 动力 + 寡氧单胞菌属 （嗜麦芽寡氧单胞菌） — 不动杆菌属，付百日咳鲍特氏菌 在鲍—金二氏培养基上产 棕色素 麦康凯上生长 — + 不动杆菌属
+ —
付百日咳鲍特氏菌
）、氧化酶阳性菌群的 鉴别
氧化酶阳性菌群
假单胞菌属，产碱杆菌属，黄杆菌属， 支气管败血鲍特氏菌，金氏杆菌属，无色杆菌属， 莫拉氏菌属，艾肯氏菌属，土壤杆菌属。 触酶 + 假单胞菌属，产碱杆菌属，黄杆菌属， 支气管败血鲍特氏菌，无色杆菌属， 莫拉氏菌属，土壤杆菌属 动力 37℃ 18—24 ℃ — + 支气管败血 鲍特氏菌 + + 假单胞菌属 产碱杆菌属 无色杆菌属 土壤杆菌属 + 黄杆菌属 黄色素 — 莫拉氏菌属 — — 黄杆菌属 莫拉氏菌属 弱 F 金氏杆菌属 — 金氏杆菌属， 艾肯氏菌属 O/F — 艾肯氏菌属
绿棕红无 部分黄色 — 黄 —/棕 — — — — — —
+（周毛） O 型
+（周毛） O 型
非发酵菌群 氧化酶 + 假单胞菌属，产碱杆菌属，黄杆菌属， 支气管败血鲍特氏菌，金氏杆菌属， 无色杆菌属，莫拉氏菌属，艾肯氏菌属， 土壤杆菌属。 — 不动杆菌属 寡氧单胞菌属 付百日咳鲍特氏菌
【临床微生物实验】_非发酵菌概述、假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌
引起的疾病?
条件致病菌 （opportunistic pathogen） ➢ 尿路感染（ urinary tract infections） ➢ 呼吸系统感染（respiratory system infections） ➢ 皮肤软组织感染（dermatitis, soft tissue infections） ➢ 菌血症（ bacteremia） ➢ 骨关节感染（ bone and joint infections） ➢ 胃肠感染（gastrointestinal infections ） ➢ 各种系统感染尤其是严重烧伤患者、伴有免疫抑制
➢ 分布广泛 多存在于潮湿环境 ➢ 条件致病 皮肤粘膜破损感染 （烧伤患者感染等） 医院感染 （呼吸道、泌尿道
等感染）
Pseudomonas形态和培养特征
形态：杆菌 染色性：革兰阴性 排列：散在排列 特殊结构：
有鞭毛（端、丛） 有菌毛 无芽胞 无荚膜
Pseudomonas形态和培养特征
➢培养特征：
➢ 2006年发展到12家（2所儿童医院，以及新疆和甘 肃的2 所）
➢ • 2009年发展到14家（昆明和安徽的2所） 按统一 方法（K-B法）、标准化的材料进行动态性耐药性 监测
➢ The SENTRY Antimicrobial Surveillance Program was initiated in January 1997 and was designed to monitor the predominant pathogens and antimicrobial resistance for both nosocomial and community-acquired infections globally by using validated, reference-quality identification and susceptibility testing methods performed in a central laboratory.
微生物检验第二十章 不发酵菌及检验练习
第二十章不发酵菌及检验一、A11、非发酵菌是指一群不发酵或不分解糖类的A、革兰阴性无芽胞需氧杆菌B、革兰阴性无芽胞厌氧杆菌C、革兰阴性球菌D、革兰阳性芽胞需氧杆菌E、革兰阳性芽胞厌氧杆菌2、在普通琼脂培养基中可产生多种色素是A、不动杆菌B、产碱杆菌C、铜绿假单胞菌D、黄杆菌E、莫拉菌3、在含有蛋白胨的肉汤培养基中产氨，使pH上升至8.6的细菌是A、假单胞菌属B、不动杆菌属C、产碱杆菌属D、黄杆菌属E、莫拉菌属4、铜绿假单胞菌可产生的多种致病物质是A、内毒素，外毒素，菌毛B、内毒素，外毒素，芽胞C、内毒素，菌毛，芽胞D、外毒素，菌毛，芽胞E、外毒素，菌毛，黏附素5、铜绿假单胞菌引起的局部感染常见于A、失血性休克B、烧伤或创伤后C、尿路感染D、肠道感染E、介入性治疗后6、铜绿假单胞菌培养特性为A、专性需氧B、专性厌氧C、兼性厌氧D、微需氧E、以上都是7、军团菌生长对营养和培养环境的要求严格，其中哪种物质是军团菌生长所需要的A、丝氨酸和铁B、蛋氨酸和半胱氨酸C、苏氨酸和铁D、苯丙氨酸和半胱氨酸E、半胱氨酸和铁8、军团菌感染后，不易采集哪种标本进行微生物学检查A、痰B、肺泡盥洗液C、粪便D、活检肺组织E、血9、下列最适宜用于军团菌培养的培养基是A、BCYE琼脂培养基B、庆大霉素培养基C、巧克力培养基D、吕氏鸡蛋血清培养基E、亚碲酸盐血琼脂10、下列有关嗜肺军团菌的描述，错误的是A、生长繁殖较快B、有鞭毛，无芽胞C、最适生长温度35℃D、主要通过呼吸道传播E、培养需用含半胱氨酸和铁的培养基11、军团菌感染的首选治疗药物是A、青霉素B、阿米卡星C、加替沙星D、红霉素E、左氧氟沙星12、对非发酵菌的叙述正确的是A、分解糖类（+）、革兰阴性、杆菌B、分解糖类（-）、革兰阳性、杆菌C、分解糖类（-）、革兰阴性、球菌D、分解糖类（+）、革兰阳性、杆菌E、分解糖类（-）、革兰阴性、杆菌二、A21、女，22岁，住院一周后出现呼吸道感染症状。
非发酵菌及检验
3、检先增菌，再转 种血平板和麦康凯平板分离；脓汁、分泌物、 尿可直接种于上述培养基分离培养。
（3）鉴定：根据菌落特征、色素、 生姜气味、菌体形态、氧化酶试验等 作出鉴定。对无色素的菌株应与其他 假单胞菌鉴别。
铜绿假单胞菌的检验程序：
血液 体液
脑脊液、胸腹水、脓汁、痰、尿液 粪便
分离培养 血、麦康凯
增 菌 营养肉汤
直接涂片染色
分离培养 SS、麦康凯
初步鉴定 菌落特征，色 素 菌体形态、氧化酶
最后鉴定
生化反应
分型：血清学
噬菌体
铜绿假单胞菌的鉴定要点及与其他假单胞菌的区别
试 验 铜绿假 单胞菌 ＋ 荧光假 单胞菌 ＋ 恶臭假 单胞菌 ＋ 斯氏假 单胞菌 ＋ 嗜麦芽 假单胞 ＿ 鼻疽假 单胞菌 ＋/＿ 类鼻疽 假单胞 ＋
挑选可疑菌落
最后鉴定 生化反应
初步鉴定 KIA：底层、斜面不变 硝酸盐还原、氧化酶、 动力
不动杆菌属主要菌种生化反应特征
醋酸钙不 动杆菌 鲍曼不 动杆菌 溶血不 动杆菌 琼氏不 动杆菌 约翰逊 不动杆菌 洛菲不 动杆菌
葡萄糖氧化
木糖氧化 乳糖氧化 精氨酸双水解酶
＋
＿ ＋ ＋
＋
＋ ＋ ＋
+/_
+/_ ＿ ＋
琼氏不动杆菌
约翰逊不动杆菌
一、生物学性状
形态与染色 革兰阴性球杆菌，常成双排列， 不易退色，多数有荚膜、无芽孢、无鞭毛。 培养特性 专性需养，营养要求不高。
最适温度35℃ ，鲍曼不动杆菌42℃可生长。 血平板上 圆形凸起、2~3 mm ，光滑、边 缘整齐、灰白色的菌落，部分菌落呈黏液状（溶 血不动杆菌可形成 β -溶血环）； 不产生色素。 麦康凯平板 形成粉红色菌落。
非发酵菌的培养与鉴定
铜绿假单胞菌在血平板上的菌落形态
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)
3.粗糙型：菌落呈纽扣状，表面 粗糙或菌落中央隆起边缘扁平。
铜绿假单胞菌在血平板和巧克力平板上的菌落形态
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)
4.粘液型：菌落光滑，隆起，呈黏液 状，嵌入培养基中，不易挑起，似肺炎克 雷伯菌菌落，但菌落呈无色半透明。
结果判读：出现红色为 阳性，不变色为阴性。
氧化酶阳性
非发酵菌生化鉴定反应共选“套餐”
各生化管阴阳性结果的判读
斜面产碱，底层不变 H2S阴性K/K，H2S-
斜面产酸，底层产酸 斜面产碱，气体阴性，
产气， H2S阴性（A/A, H2S阳性（K/A,气体
气体+，H2S-）
+，H2S+）
动力实验 左管阳性，右管阴性
嗜血杆菌鉴定实验：“卫星现象”
原理：嗜血杆菌生长需要Ⅴ因子和（或）Ⅹ因子，血平 板中红细胞本身含这两种因子，Ⅹ因子溶血后可直接 释放，Ⅴ因子会被溶血时释放的NAD酶水解，而金 黄色葡萄球菌等在生长中能产生Ⅴ因子，因此，将这 两种细菌共培养时，释放或产生的因子可以促进嗜血 杆菌的生长，从而出现靠近金黄色葡萄球菌周围环绕 较大的嗜血杆菌菌落。该现象称之为卫星现象。
非发酵菌和嗜血杆菌的培养和鉴定
苏州大学附属第二医院 微生物室 周惠琴
非发酵菌和嗜血杆菌的培养和鉴定
1 实验目的 2 实验内容 3 操作步骤 4 结果观察
一.实验目的
1.掌握常见非发酵菌的菌落特点、染色形 态及生化反应鉴定实验。
2.掌握嗜血杆菌属的菌落特点及鉴定实验。
二.实验内容
非发酵菌的鉴定
非发酵菌的鉴定定义：非发酵菌（nonfermenters）指一群需氧或兼性厌氧、不发酵糖类，能在普通培养基上生长的革兰阴性杆菌。
主要存在外界环境中，种类繁多，多为条件致病菌或医院内感染菌。
关于临床标本中NFB的意义，在混合培养物中见到时，必须考虑到患者的情况和标本来源。
一般来说，以纯培养方式分离自正常无菌部位的NFB，一定要鉴定到种并进行抗生素敏感性试验。
目前CLSI中，K-B法除了假单胞菌属、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌有抗生素敏感性实验的判断标准外，其他非发酵菌没有K-B法的标准。
一、鉴定原则：1．血、无菌部位（脑脊液、胸水等），特殊病人，少见菌可用API-20NE或VIKET TWO-GN 卡鉴定。
2．其它部位如呼吸道标本、临床常见的非发酵，根据菌落形态、生化反应、抗生素耐药谱等综合分析手工法鉴定即可。
二、非发酵性菌基本分类：假单胞菌属Pseudomonas spp.（20多个临床上重要菌种中，铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌等最常见。
）不动杆菌属Acinetoacter spp.（最常分离的种鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌、溶血不动杆菌等）窄食单胞菌Stenotrophomonas spp.（嗜麦芽窄食单胞菌、非洲嗜麦芽窄食单胞菌）伯克霍尔德菌Burkholderia spp.（洋葱伯克霍尔德菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌等）鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas spp.（少动鞘氨醇杆菌）无色杆菌属Achromobacter spp.（木糖氧化无色杆菌）希瓦氏菌属Shewanella spp. （腐败希瓦氏菌海藻希瓦氏菌）产硷菌属Alcaligenes spp.黄杆菌属Flavoacterium spp.莫拉菌属Moraxella spp.罗尔斯通菌属 Ralstonia spp.食酸菌属Acidovorax spp.丛毛单胞菌属Comamonas spp.甲基杆菌属Methylobacterium spp.等还有一些未定名的菌群三、辨认非发酵菌的基本要点1. 分离培养基上的菌落有以下情况初步考虑非发酵菌的存在a.培养基上生长较差或中国蓝上不生长的阴性菌。
12第十二章 非发酵菌检验
• 铜绿假单胞菌含有多种毒力因子，包括黏附素、内毒素、外毒素、多糖荚膜样物 质、绿脓菌素（pyocyanin）及侵袭性酶类等，在细菌的侵入、扩散和感染中发挥 重要作用。临床上，铜绿假单胞菌可引起伤口和创面感染、呼吸道感染、泌尿道 感染、败血症等。重度感染可发生在局部组织损伤或抵抗力下降人群，如烧伤， 长期卧床者，呼吸机使用者，应用广谱抗生素、激素、抗肿瘤药物及免疫抑制剂 等药物的患者，以及早产儿，囊性纤维化患者，艾滋病和老年患者等。对于烧伤 患者的伤口感染，应特别注意防范脓毒症的发生，以降低感染后的死亡率
抗生素
微生物 鲍曼/醋酸钙不动杆菌群 洋葱伯克霍尔德菌 铜绿假单胞菌 嗜麦芽窄食单胞菌
氨 苄 西 林
阿 莫 西 林
哌 拉 西 林
替 卡 西 林
氨 苄 西 林 / 舒 巴 坦
阿 莫 西 林 / 克 拉 维 酸
哌 拉 西 林 / 他 唑 巴 坦
头 孢 噻 肟
头 孢 曲 松
头 孢 吡 肟
氨 曲 南
亚 胺 培 南
• 典型的铜绿假单胞菌具有特殊气味（生姜味）和菌落特征（金属或珍珠般光泽、 粗糙、产色、有时极其黏稠），临床可结合革兰染色和氧化酶实验进行初步鉴定 。铜绿假单胞菌与属内其他临床常见菌种的鉴别特征见表12-4
临床微生物学检验技术
表12-4 临床常见假单胞菌的鉴别 试 验
铜绿
荧光
恶臭
斯氏
门多萨
假产碱
产碱
临床微生物学检验技术
表12-1 常见非发酵菌的初步分群鉴定
细菌分类
菌落色素
氧化酶
假单胞菌属
不定
非发酵菌的鉴定的临床探讨
非发酵菌的鉴定的临床探讨发表时间：2011-08-31T14:47:05.327Z 来源：《中外健康文摘》2011年第19期供稿作者：吕春凤[导读] 非发酵菌主要是指一大群不发酵糖类、专性需氧、不产生芽胞的革兰阴性杆菌。
吕春凤（黑龙江省绥滨农场疾病控制中心 156203）【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）19-0284-02 【关键词】非发酵菌鉴定探讨非发酵菌主要是指一大群不发酵糖类、专性需氧、不产生芽胞的革兰阴性杆菌。
在临床微生物学实验室遇到所有革兰阴性杆菌中，非发酵菌占15%，其中2/3是假单胞菌。
非发酵菌大多为机会致病菌，是引起医院内感染的重要致病菌。
临床标本中遇到的非发酵菌有近10个菌属的数十个种别。
主要菌属有假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、莫拉菌属、金氏杆菌属、黄杆菌属、艾肯菌属、土壤杆菌属等。
1 假单胞菌属1.1 生物学特性直或微弯杆菌，长1.5～5.0μm，宽0.5～1.0μm，革兰染色阴性。
单端鞭毛，1根或数根，有动力。
严格需氧代谢。
氧化酶阳性，触酶阳性。
1.2 常规鉴定从临床标本中分离到的非发酵菌，大约占所有革兰阴性杆菌中的15%，其中铜绿假单胞菌占70%，其次是不动杆菌属，嗜麦芽窄食单胞菌占第三位，荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、斯氏假单胞菌较少见。
荧光假单胞菌DNA 同源群的鉴定。
该群有3个菌种，铜绿、荧光和恶臭假单胞菌，主要生物学特性是能产生水溶性色素，如青脓素或称荧光素，绿脓素不发荧光，可用氯仿从培养液抽提获得。
此外，尚有少数菌株可产生红脓素、黑脓素，也有不产色素的菌株。
氧化酶阳性、精氨酸双水解酶阳性，一般能在麦康凯琼脂上生长，利用枸橼酸盐，对多粘菌素敏感。
氧化葡萄糖、蔗糖无反应。
据统计，临床标本中铜绿假单胞菌不产绿脓素的菌株约占10%，既不产生绿脓素亦不产生青脓素的也占10%左右。
对于不产生绿脓素的铜绿假单胞鉴定最低限度应具有以下特性：端极一根鞭毛，有动力，在O-F葡萄糖培养基需氧管中产酸，氧化酶阳性，精氨酸双水解酶阳性，42℃生长，其他如硝酸盐还原产生氮气，麦康凯琼脂上生长，对多粘菌素敏感皆有鉴定参考价值。
微生物学检验非发酵菌及检验
涂片 染色镜检
标本
分离培养 （血平板、麦康凯）
可疑菌落
血标本 增菌
涂片 动力观察 革兰染色 鞭毛染色
氧化酶
O/F 硝酸盐还原
KIA斜面底层不变色 其他生化反应
测验1
关于铜绿假单胞菌，错误的是 A 革兰阴性杆菌 B 氧化酶－、触酶－ C 硝酸盐还原－ D 产生水溶性蓝绿色素 E 菌落有金属光泽
测验2
黄杆菌科
革兰阴性杆菌，无鞭毛 专性需氧、营养要求不高，普通平板上 生长，形成黄色色素 麦康凯平板上不生长 氧化酶＋ O/F：O
莫拉菌属
革兰阴性球杆菌 ，不易脱色，成双排列 （与奈瑟菌相似），无鞭毛，部分菌株 有荚膜 专性需氧，营养要求高，普通平板上不 生长 氧化酶＋ O/F：－
非发酵菌－－检验程序
流感嗜血杆菌与金 黄色葡萄球菌在血 平板上共同孵育时， 由于后者能合成较 多的V因子，在金黄 色葡萄球菌菌落周 围生长的流感嗜血 杆菌的菌落较大， 离金黄色葡萄球菌 菌落越远的越小。
卫星现象
根据荚膜抗原分ABCDEF六型，B型 毒力最强
可产生自溶酶
致病物质：荚膜、菌毛、内毒素、 IgA蛋 白酶
所致疾病
军团菌
是引起军团菌病的病原体 首发于1976年的美国一次军人聚会，故 称作军团病 1982年,在我国南京首次证实了军团菌病。
形态染色
革兰阴性，但不易被着色 杆菌，形态有多形性 Gimenen染色，菌体呈红色，背景为绿 色 不形成芽孢，无荚膜 ， 有端生或侧生鞭毛
培养特性
营养要求高 专性需氧 需～5％CO2 生长缓慢 常用培养基及菌落特征 BCYE培养基：灰白色、圆形光滑湿润菌落 F-G培养基：针尖大小、黄色荧光
铜绿假单胞菌－－分型检查
非发酵菌检验程序(详细版)
非发酵菌是一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、条件致病菌。
【氧化酶试验】铜绿、粪产碱为阳性，醋酸钙不动杆菌为阴性【非发酵菌生化编码管鉴定】原理：该系列鉴定共有9种生化培养基，共10项试验，参照下述方法，将试验结果换算成4位数字, 加以数值化后查表。
例：某一分离菌株，具有下列鉴定结果，数值化后为1734，查表得知：可能为施氏假单胞菌和洋葱单胞菌，再按表中要求做硝酸盐产气补充实验区分。
无芽胞的革兰阴性杆菌；多为- 4组0-F厌顿2分需氧1分结果：需氧得分匸12组氧化輕分枸携酸2分麦芽犍1分+ + +73纠精氨就4分甘露醇2分木糖1分-+ +4组硝还4分DNA酶2分乙酰胺4分观察结果时按表中说明进行。
—、O-F试验接种2支编码管，1支加无菌石蜡油，另1支不加。
原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。
本试验又称氧化发酵（0/F或Hugh —Leifson , HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；培养基表面和底部都产酸（变黄）为发酵型；培养基表面变为深蓝色为产碱型；培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。
二、硝酸盐还原试验原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐，生成亚硝酸盐和氮气等。
硝还试验是测定还原过程中生成的亚硝酸盐。
如培养基中有亚硝酸盐存在，则亚硝酸盐与醋酸生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸，后者与a -萘胺结合成N- a -萘胺偶氮苯磺酸。
假单胞菌等能使硝酸或亚硝酸盐还原为氮气，此为脱硝化或脱氮化作用。
结果解释：/变红一®性沿试验管加AB液各少许变一加锌粉-不变r阳性，产气\变红阴性注意事项：若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否已被还原，可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色，表示硝酸盐仍然存在；若不出现红色，表示硝酸盐已衩还原为氨和氮。
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成都医学院 临床微生物学教研室
目的
❖ 1.掌握非发酵菌的形态、染色性和菌落特征。 ❖ 2.熟悉非发酵菌的主要生化反应。
器材
❖ 接种环、酒精灯、显微镜等
试剂
❖ 革兰染液、氧化酶试剂、非发酵菌编码生化 鉴定管及相关试剂、生理盐水等
标本
❖ 1#标本和2#标本
操作
❖ 1.标本涂片染色镜检 ❖ 2.接种、培养 ❖ 3.生化试验 ❖ （1）氧化酶试验 ❖ （2）非发酵菌编码生化鉴定管
1组 O-F试验 厌需 氧氧
01
2组 氧枸 麦 化橼 芽 酶酸 糖
42 1
3组 精甘木 氨露糖 酸醇
421
4组
硝D乙酸N酰盐 还Fra bibliotekA 酶
胺 酶
原
421