非发酵菌 微生物学检验

非发酵G-杆菌(nonfermentative G- Bacilli)
1. 非发酵菌是一群需氧、无芽孢、不利用糖或仅能氧化分解糖类是做为能量来源的G-杆菌。

（1）通常所讲的非发酵菌指在KIA中24小时内表面能够生长，在底部不生长的需氧G-杆菌。

（2）非发酵菌与其它苛养或非糖发酵的G-杆菌之间的界限只是传统意义上的，并不是根据明确的遗传或表型特点来划分。

（3）多为条件致病菌，近年来日益增多，尤其是医院感染。

2. 分类与命名：主要的非发酵G-杆菌属被分成6个科：
（1）假单胞菌科：根据rRNA-DNA同源性分为5个rRNA群
①rRNAⅠ群/假单胞菌属；②rRNAⅡ群/伯克霍尔德菌属；③rRNAⅢ群/丛毛单胞菌属、食
酸菌属；④rRNAⅣ群/短波毛单胞菌属；⑤rRNAⅤ群/窄食单胞菌属；⑥其它：鞘氨醇单胞菌属、希瓦菌属等
（2）产碱杆菌科：产碱杆菌属；（3）黄杆菌科：华丽杆菌属
（4）莫拉菌科：不动杆菌属、莫拉菌属；（5）甲基球菌科；（6）根瘤菌科
3. 非发酵菌的基本鉴定要求
（1）缺少糖发酵的证据，通常是在KIA或TSI培养基中无酸产生，斜面和底部均呈红色。

（2）氧化酶+（不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、唐菖蒲伯克菌、浅黄华丽单胞菌、栖稻黄素单胞菌-），但并非所有氧化酶+的G-杆菌都是非发酵菌。

（3）麦康凯上生长很差或不生长。

（4）动力：多为+，但多为专性需氧，故半固体培养基中不明显，宜用直接动力观察或染色法。

4. 重要的鉴定试验
（1）葡萄糖利用（O/F试验）：O/F培养基:蛋白胨和糖类的比例为1:5而不同于发酵菌的1:2。

（2）氧化酶试验：
（3）动力：半固体培养基:应只穿刺培养基顶部4mm，在培养4-6小时后首次观察结果,24和48小时后再次观察结果。

更准确的方法是湿片法和鞭毛染色。

（4）色素形成：非发酵菌可形成多种色素，有助于菌种的鉴定。

（5）硝酸盐还原/产气：将硝酸盐还原成亚硝酸盐，进而释放氮的生化过程。

（6）吲哚试验：需用含色氨酸丰富的培养基，产吲哚黄杆菌、脑膜败血黄杆菌、食酸丛毛单胞菌等+。

（7）硫化氢：腐败希瓦菌是非发酵菌中唯一在KIA和TSI上产硫化氢的菌种。

5. 常见不发酵G-杆菌的初步分群鉴定
6.O-F试验：O/F培养基（蛋白胨和糖类的比例为1:5），溴甲酚紫指示剂，其中一管用石蜡密封，另一管暴露于空气中。

（一）、. rRNAⅠ群/ 假单胞菌属(Pseudomonas)
1.（1）直或微弯无芽孢G-杆菌，OXI+，动力+（一个或多个极鞭毛），严格需氧，氧化利用葡萄糖、触酶+、McC生长，水溶性色素。

（2）本属包括铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌、门多萨假单胞菌、产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌。

2. 铜绿假单胞菌
（1）分布广泛，是非发酵菌中最具临床意义的细菌，也是医院内感染最多见的细菌，主要引起条件感染。

（2）感染多发生于烧伤、急性白血病、器官移植病人及静脉药瘾者，感染多位于潮湿部位，如气管造口、留置的导管、创面、外耳道、角膜和渗出性皮肤伤口处
（3）囊性纤维化病人呼吸道分离的铜绿假单胞菌具有生物膜（其产生的大量藻酸盐包围了菌体所致），导致本病的治疗困难和高死亡率。

（4）其淡蓝色脓性渗出物及绿脓素的生姜样气味具有特征性。

3. 铜绿假单胞菌的耐药性
（1）本菌对氨苄西林、安美汀、四环素、优力新、一、二代头孢菌素、头霉素、大环内酯类、磺胺等天然耐药
（2）各种抗生素治疗过程中都可能产生耐药，耐药率及多重耐药株上升较快。

（3）耐药机制：生物膜及外膜障碍、胞外灭活或钝化酶、主动外排系统将抗生素泵出胞外、抗菌药物作用靶位改变
4. 生物膜
（1）生物膜由依靠胞外产物而吸附于固体表面的微生物集落构成，并能结合有机和无机成分，形成包含复杂的理化过程和生物群落的相互作用。

（2）如正常菌群与上皮细胞表面受体结合而黏附，并分泌胞外多糖聚合物，使细菌以非常精细的方式相互粘连，形成膜状物，能发挥屏障和占位性保护作用，使外来病菌不能定植而通过侵入门户侵袭机体。

5. 铜绿假单胞菌感染的控制：（1）易感危重病人不应安排在已有过铜绿假单胞菌感染的病
房；各种抗菌药物、溶液、软膏、器械等应避免被铜绿假单胞菌污染；采取适当的分型方法对感染菌株进行流行病学调查和监控；噬菌体治疗：
6. 铜绿假单胞菌的检验
（1）标本采集：按疾病和检查目的，分别采取不同的标本：患者的血液、脑脊液、胸(腹)水、脓液、分泌液、痰、尿液、十二指肠引流液、粪便等；
（2）医院病区或手术室的空气、水、地面、把手、医疗诊断器械及生活用品。

（3）标本镜检为G-，有动力的杆菌
（4）分离培养：普通培养基经18-24h形成圆形、扁平隆起、光滑湿润菌落。

大多数产生绿脓素或荧光素。

少数可产生其他颜色色素，如红脓素（红色），黑脓素（棕色到黑色），青脓素（黄色）。

McC经18-24h形成微小无光泽半透明菌落，48h菌落中心呈棕绿色。

（5）生化鉴定：氧化酶+，氧化分解葡萄糖、木糖产酸不产气，液化明胶，还原硝酸盐产生氮气，吲哚-，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶+。

（1）形态学特性：细长G-杆菌，极单鞭毛，
（2）培养特性：A. 严格需氧，氧化利用葡萄糖、McC生长，最适生长温度35℃，4℃不生长，42℃可生长；B. 在普通琼脂平板上产生特征性的蓝绿色水溶性绿脓素和黄绿色青脓素（荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌也可产生）；C. 血平板上形成大而扁平，湿润，边缘不齐，有金属光泽，有生姜气味的灰绿色菌落，并形成透明溶血环；D. 有时可产生水滴样菌落，无色素不溶血（囊性纤维化病人）；
（3）铜绿假单胞菌的分型：药敏分型、血清学分型：菌体O及H抗原、噬菌体分型、质粒指纹图谱分析、重复序列PCR、脉冲场凝胶电泳；
（4）检验结果分析与报告：结合临床感染症状进行分析；患者血、尿液及无菌体液中分离到铜绿假单胞菌，特别是反复检出即可确定是感染病原菌；如无感染的临床表现，应作为正常菌群。

7. 荧光假单胞菌
（1）见于水和土壤中，都可作为咽部的正常菌群存在，是人类少见的条件致病菌
（2）荧光假单胞菌和污染的血液制品关系密切，可见于近期接受过血液制品而致菌血症的患者。

（3）丛极鞭毛，产青脓素，但不能产绿脓素，4℃生长, 42℃不生长, 最适温度25-30℃。

（二）、rRNAⅡ群/ 伯克霍尔德菌属
1.（1）所有rRNAⅡ群的细菌都被归入一个新属，伯克霍尔德菌属(Burkholderia)。

（2）本属菌包括13个种，其中伪马勒伯克霍尔德菌B. pseudomallei、洋葱伯克菌B. cepacia、唐菖蒲伯克氏菌B. gladioli和皮氏伯克菌B. pickettii与人类疾病相关
（3）本属其他菌种与植物或动物有关而与人类疾病无关。

2. 伪马勒伯克霍尔德菌
（1）生长有特定的生态区域，存在于赤道南北纬20度之间的土壤和不流动的水中，主要在泰国和越南。

本菌在美国主要是从越战士兵和去东南亚的旅游者中发现，可致人或动物类鼻疽。

（2）大多数感染无症状，只能通过血清学诊断。

（3）本菌的一个特点是可潜伏感染，首次接触多年后复发。

传播主要是通过呼吸道或破损的皮肤的直接接触，对类鼻疽的明确诊断依
（4）本菌在大多数实验室常规培养基中易生长，并产生皱缩形菌落，呈红棕色，在形态上同斯氏假单胞菌有些相似，另外本菌还可产生刺激性泥土气味
3. 洋葱伯克霍尔德菌
（1）是一种植物病原菌，从80年代早期开始本菌作为条件致病菌出现，在慢性肉芽肿和囊性纤维化的病人中常引起高死亡率和肺功能的全面下降。

（2）本菌是非发酵菌中仅有的两种赖氨酸脱羧酶+的细菌之一（另一种是嗜麦芽窄食假单胞菌）。

（3）可从各种水源和潮湿表面分离到，能在某些消毒剂（如铵盐、聚维酮碘、洗必泰等）中生长，也可生长于有氮源的蒸馏水中
（4）本菌对氨基糖苷类抗生素耐药，对TMP/SMZ敏感，因此常用此药治疗洋葱伯克菌感染。

3. 伯克霍尔德菌属微生物学检查法
（1）标本：脓液、血液、鼻液等；
（2）直接涂片镜检：荧光染色法；
（3）分离培养与鉴定：BAP、MAC；
（4）抗原检测：LPS、蛋白共同Ag；
（三）、rRNAⅢ群
（1）包括两个菌属：丛毛单胞菌属Comamonas和食酸菌属Acidovorax；
（2）食酸丛毛单胞菌是本属菌中最常从临床标本中分离到的，可通过OF果糖和甘露醇产酸、乙酰胺+而与其他菌相区别，还是产生桔黄色吲哚反应的唯一细菌；
（四）、rRNAⅣ群/ 短波毛单胞菌属
（1）短波毛单胞菌属B. revundimonas包括两个菌种：缺陷短波毛单胞菌B. diminuta和泡囊短波毛单胞菌B.vesicularis
（2）具有一条短波（0.6-1μm）紧密螺旋的单极鞭毛。

对大多数碳水化合物无反应或反应很弱，属于产碱的假单胞菌。

（3）泡囊短波毛单胞菌生长缓慢，通常需培养48小时才可见菌落，并产生深黄到桔黄的色素，通过七叶苷水解+而易与其他假单胞菌区别。

（五）、rRNAⅤ群/窄食单胞菌属
（1）窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）是一个新命名的菌属，有2个菌种，嗜麦芽窄食单胞菌S. maltophilia和S. Africana。

（2）在1961年根据其鞭毛特征命名为嗜麦芽假单胞菌，1983年根据核酸同源性和细胞脂肪酸组成等归入黄单胞菌属，命名为嗜麦芽黄单胞菌，但由于其无黄单胞菌素，无植物病原性，能在37℃生长，且为极丛鞭毛，与其他黄单胞菌不同。

（3）1993年此菌命名为嗜麦芽窄食单胞菌
1. 嗜麦芽窄食单胞菌
（1）分布广泛，可引起条件感染，是临床第三位最常见的非发酵菌，是一种重要的医院获得性病原体，本菌可分离于几乎所有部位，最常见的是呼吸道。

（2）可致多种疾病，包括肺炎、菌血症、心内膜炎、胆管炎、脑膜炎、尿道感染和严重的伤口感染等。

（3）危险因素：机械通气、广谱抗生素的预防性应用、化疗、插管和中性粒细胞减少等。

嗜麦芽窄食单胞菌
（4）下列特征可用来推测性鉴定：①在血平板或麦康凯平板上生长良好；②氧化酶-；
③O/麦芽糖产酸，但O/葡萄糖可-；④赖氨酸脱羧酶+；⑤一些菌株产黄色色素；
⑥抗生素敏感方式：对大多数抗生素耐药，包括氨基糖苷类和碳青霉烯类，但对
TMP/SMZ敏感。

（5）嗜麦芽窄食单胞菌为有动力杆菌，具有丛极鞭毛，血平板上菌落粗糙呈淡黄色或浅绿色，有氨气味。

（6）根据赖氨酸脱羧酶试验+和DNA酶+、氧化酶-可很容易与其他假单胞菌区别，本菌葡萄糖氧化缓慢，可快速氧化分解麦芽糖。

（7）本菌的一个重要特征是对氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类天然耐药，但TMP/SMZ天然敏感。

不动杆菌属
1. 开始被归于奈瑟菌科，但最近又被归入莫拉菌科。

根据DNA-DNA杂交和营养特征将不动杆菌属分为25个基因种，但只有10个基因种有菌名：乙酸钙不动杆菌，主要分离自土壤、鲍曼不动杆菌、溶血不动杆菌、琼氏不动杆菌、约翰逊不动杆菌、洛菲不动杆菌
2. 鲍曼不动杆菌
（1）广泛分布于自然和医院环境中，能在潮湿和干燥的表面生存，也可存在于健康人的皮肤，通常不致病，但对体弱者可引起感染。

在临床标本中的分离阳性率居第二位，仅次于铜绿假单胞菌。

（2）能在大多数环境表面生存和获得多重耐药性，所以由本菌引起的医院获得性感染有增加的趋势，最常见的是呼吸道、手术部位、应用器械或ICU的住院患者。

（3）所致疾病包括肺炎、心内膜炎、脑膜炎、皮肤和伤口感染、腹膜炎和尿道感染等。

（4）不动杆菌对青霉素、氨苄青霉素和头孢他啶均耐药，大多数菌株对氯霉素耐药，对氨基糖苷类抗生素耐药的菌株也逐渐增多，不同菌株对二代和三代头孢菌素耐药性不同，所以每个分离菌株都应进行药敏试验。

多重耐药菌株最常多见于鲍曼不动杆菌和溶血不动杆菌。

3. 不动杆菌属检验程序
4. 不动杆菌属－－鉴定要点：G-球杆菌、无动力、氧化酶－、硝酸盐还原－、KIA：底层斜面不变色、注意与形态相似的奈瑟菌鉴别、注意与不分解糖的产碱杆菌鉴别。

5. 鲍曼不动杆菌
（1）形态特征：常似双球菌，有时不易脱色，易误认+菌；
（2）生理学特征：
A. 严格需氧、OF试验为产碱型、无动力、氧化酶-、硝酸盐还原-、G-球杆菌。

B. 血平板培养24小时后，菌落大小0.5-2mm，半透明到不透明，凸起，边缘整齐，无色素形成；
C. 大多数菌株麦康凯平板上生长良好，呈无色或淡粉红色
产碱杆菌属
1. 产碱杆菌为氧化酶+的G-杆菌，麦康凯上生长，通过周鞭毛运动，在含蛋白的肉汤中产氨，不发酵任何糖类，OF为产碱型，多数生化反应-。

2. 产碱杆菌属:
（1）木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种通过使OF葡萄糖和OF木糖产酸而很容易和其他产碱杆菌区别，可从血、脑脊液、支气管冲洗液和伤口等分离到，本菌可引起医院内感染，如使住院病人引起肺炎，菌血症和脑膜炎等。

（2）木糖氧化产碱杆菌脱硝亚种较少从临床标本分离到，主要见于血、耳、脑脊液和尿。

（3）粪产碱杆菌大部分感染是条件致病，主要来自潮湿环境，如雾化器、呼吸机和灌洗液等，血、痰、尿是常见发现部位。

黄杆菌属
（1）自然存在于土壤、水、植物和粮食中，在医院主要存在于有水的环境和潮湿表面，引起术后感染、败血症、新生及婴幼儿脑膜炎等。

（2）在BAP上生长良好，菌落呈黄色。

动力-、氧化酶+、吲哚-
1. 华丽杆菌属
（1）自然存在于土壤、水、植物和粮食中，在医院主要存在于有水的环境和潮湿表面，已引起医院感染。

（2）脑膜脓毒华丽杆菌产生很浅的黄色素，是使人类致病最相关的菌种，对早产儿具有高度致病性，可致新生儿脑炎，此病的准确诊断很重要，可在婴儿室引起流行，而且死亡率较高，此菌也可引起成人肺炎，主要是免疫力低下者。

此菌对碳青霉烯类天然耐药
（3）华丽杆菌在麦康凯上一般生长较弱或完全不生长。

（4）动力-、氧化酶-、吲哚+，产吲哚华丽杆菌是本属临床标本中最常分离到的菌株，因其菌落呈深黄色所以很容易认出。

2. 卡他布兰汉菌
（1）上呼吸道粘膜的正常菌群，常引起老年病人的下呼吸道感染。

（2）G-双球菌，血平板和巧克力培养基培养，菌落为不透明、干燥、红棕色。

（3）氧化酶(+)，触酶(+)，不分解麦芽糖和葡萄糖，DNA酶(+)。

3. 莫拉菌属
（1）与临床有关的有缺陷莫拉菌、犬莫拉菌、非液化莫拉菌、亚特兰大莫拉、林肯莫拉菌、苯丙酮酸莫拉菌、奥斯陆莫拉菌。

DNA G+C为40～47.5％。

（2）能引起眼结膜炎、气管炎、肺炎、脑膜炎、脑脓肿、心炎、心内膜炎及泌尿生殖系统炎症。

近年来非液化莫拉菌引起脑膜炎及婴幼儿菌血症者日益多，应引起高度重视。

4. 微生物学检查
（1）Ｇ-球杆菌，双短链状排列，具有多形性。

无鞭毛。

（2）营养要求较高，血琼脂平板上生长，菌落无色不溶血。

氧化酶+，触酶+，无动力，吲哚-，不分解糖类、丁酸酯酶+（与奈瑟菌鉴别）。

（3）对青霉素类敏感，对头孢类、四环素类、氨基糖苷类药物均为敏感。

军团菌属
1.（1）生存能力较强，在蒸馏水中存活100天以上，在污水中可存活1年，对热和常用化学消毒剂敏感。

（2）军团菌广泛存在于土壤及自然和人工的水环境中，尤其是在空调冷凝水中的检出率最高，其次是土壤、河水、冷却塔、医院淋浴喷头等，是医院感染的重要病原菌之一。

临床表现多种多样，高发于夏秋季，易侵犯患有慢性器质性疾病或免疫功能低下者，最常见的是肺
炎型。

（3）致病物质：微荚膜、菌毛、毒素、多种酶
（4）临床类型：流感样型（轻症型）、肺炎型（重症型）、肺外感染（庞堤阿克热pontiac fever)
（5）免疫性：嗜肺军团菌为胞内寄生菌，细胞免疫在抗感染中起主要作用
（6）红霉素治疗首选
2. 军团菌属的检验
（1）标本：痰、血液、胸水、气管分泌物等，
（2）处理：加温或酸处理
（3）镜检：GS、荧光抗体染色
（4）分离培养：缓冲活性炭酵母琼脂培养基（BCYE）3～5天形成光滑型小菌落。

血琼脂、巧克力琼脂和BCYE琼脂上24小时内生长不是军团菌
（5）鉴定：色素，氧化酶，触酶和β内酰胺酶试验
（6）血清学试验：检测病人血清中抗军团菌lgM及lgG抗体做出特异性诊断。

（7）分子生物学试验
3. 军团菌形态
G-杆菌，常规染色不易着色，用Dieterle镀银法染成黑褐色，Giemsa法染色染成红色，因培养条件不同有明显多形性，有长鞭毛，无芽孢，有微荚膜。

4. 生理学特性
（1）培养：需氧菌，首次分离需5%CO2，营养要求严格，一般营养琼脂和血琼脂上不生长，须含有半胱氨酸和铁离子，在缓冲活性炭酵母琼脂培养基（BCYE）上3-5天可形成湿润、有光泽灰白色菌落，初期外观呈刻花玻璃样花纹，继续培养消失。

（2）生化反应：在含糖培养基上不生长，氧化酶弱+，触酶+，β内酰胺酶+
5. 药物敏感试验
（1）临床治疗药物为红霉素，可加用利福平，而氨基糖苷类抗生素、青霉素、头孢菌素类抗生素对本菌无效。

（2）药物敏感试验不做为临床常规化验项目。

非发酵菌总结
下面的原则有助于实验室发现和鉴定非发酵菌
1. 除了铜绿假单胞菌、马勒伯克菲尔德菌、伪马勒伯克菲尔德菌和脑膜脓毒华丽杆菌，非发酵菌的毒力一般较低，易于感染非发酵菌的特定环境和疾病因素包括：
1）恶性肿瘤、导管插入术、气管开口术、淋巴穿刺，透析、灌洗和瓣膜置换等。

2）长期皮质类固醇、抗生素和抗肿瘤治疗。

3）患有代谢性或慢性感染性疾病
4）烧伤、开放性伤口及各种渗出性损伤。

2. 大多数非发酵菌在不同环境中都有其自然定植部位，可成为人类感染的潜在传染源。

1）医院环境中的各种水源。

这些液体经常与住院病人的粘膜和其他身体部位发生直接接触。

2）各种仪器用具，如麻醉设备、镊子、体温计、纱布、拖把、毛巾等。

3）身体的某些潮湿部位，如腹股沟、腋窝、肘窝及甲沟等在夏天易受感染。

4）各种家畜、宠物可致其主人感染。

非发酵菌总结
3. 某些非发酵菌可引起特定的感染，败血症可由任何非发酵菌引起，而大部分非发酵菌可致肺炎或支气管炎、化脓性关节炎、尿道炎、手术和外伤后伤口感染、结膜炎等。

4. 临床分离的G-杆菌，如血平板上菌落小，麦康凯平板上不生长或生长差，KIA或TSA培养基斜面和底部均无改变，氧化酶+可怀疑为非发酵菌。

5. 很多非发酵菌对抗生素具有某种方式的多重耐药性，了解这些耐药方式有助于提供此菌株属于某种非发酵菌的最初线索。

常见菌种的鉴定
（一）排除法
临床标本中最常见的非发酵菌是铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌。

大部分菌株只需通过观察和少数生化实验便可很容易鉴定，这种快速鉴定不仅可快速为临床医生提供信息，而且省时、省力、经济。

非发酵菌
（1）氧化酶-，无动力：不动杆菌属
（2）氧化酶-，有动力：
洋葱伯克菌(93%氧化酶弱+)、唐菖蒲伯克菌、浅黄华丽单胞菌、栖稻黄素单胞菌、少动鞘氨醇单胞菌(94%氧化酶+)、嗜麦芽窄食单胞菌
（3）氧化酶+，无动力：动物伤口伯杰菌、短稳杆菌、尿道寡源菌、威克菌属、莫拉菌属、华丽杆菌属
（4）氧化酶+，有动力：产碱杆菌、洋葱伯克菌、皮氏伯克菌、类鼻疽伯克菌、铜绿假单胞菌及其他假单胞菌。