蛋白印迹操作流程
蛋白印迹仪简易操作
Tecan 蛋白印迹仪简易操作规程一、主要程序操作方法TECANRun: XX + – exit yes WASTE BOTTLE OK?exit yes INSERT TRAY ! press any key StPos Strip: XX exit yes No of Strips XX exit yes Last Aspiration no yes Proc.: 01 Yyyy - + exit yes Main< >FW Run Run Program< > Main yesStep: xx YYYY exit Test done ! Please wait you should cleanpress any key 待机模式 提示确保排空废液瓶。
使用 - / + 键选择要运行的程序。
按 yes （确认）选定程序。
把托盘插到托盘架内，关上前盖。
选择实验开始的样品条位置，默认为 StPos 1 选择要处理的样品条数 (1 至 48)，默认值为 48 程序内最后一个步骤是 ASP 吗？按 yes （是）或 no （否）。
选择开始程序步骤。
设备将显示正在执行步骤的有关信息。
实验程序执行完毕。
提示清洗（例如使用蒸馏水）管路。
Last Aspiration Cont.二、回流 该选项用于把注液系统内的试剂送回试剂瓶。
Liquid Prep. < > yesPump Back< > exit yes 选定 Pump Back （回流）选项。
All Pumps ? no yesChannel: X– + exit yesChannel: X– + exit yes如果要把所有通道内的试剂送回，则选择 yes （是）。
如果只把指定通道内的试剂送回，则选择 no （否）。
对所选通道执行回流操作。
选择下一个要清洗的通道或退出。
Run Program< > Main yes 已对所有通道执行完回流操作Channel: X 选择要回流的通道。
蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项
蛋白印迹——Western blot实验流程及注意事项各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。
此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。
Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。
这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。
特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。
印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
蛋白印迹操作流程.doc
蛋白印迹操作流程.doc
1.准备工作
（1）随机选择一批需要检测的蛋白质，进行样品处理和电泳分离。
（2）将分离出的蛋白电泳板放入转移装置中，进行蛋白转移。
（3）制备检测所需的一系统列试剂和材料，如蛋白印迹缓冲液、一定浓度的洗脱缓冲液、蛋白标记剂、蛋白质大小标准等。
（4）制备抗体，根据需要选择多克隆抗体、单克隆抗体、Avidin-Biotin（ABC）标记物等标记方法。
2.制备卤素钨酸
（1）在如下的条件下，制备5%卤素钨酸（NaCl含量0.9%）。
（2）使用100ml的蒸馏水溶解0.5克的卤素钨酸
（3）加入5毫升的有机酸
（4）使用NaCl调整盐度的水平
3.印迹膜预处理
（1）将印迹膜浸泡在甲醛中15~30分钟，使其固定。
（2）简洁地将印迹膜移入TBST中，混合2小时，以去除过度的甲醛并完成等离子体凝聚。
（3）用TBST轻轻洗涤印迹膜，避免与它毛刺的任何物质接触。
4.印迹
（1）准备好蛋白转移的印迹膜。
（2）制备好一定浓度的洗脱缓冲液。
（3）使用对应的逐层标记试剂标记蛋白质。
（4）将带有标记蛋白的印迹膜在洗脱缓冲液中浸泡，使其伸展。
（5）在绿色和蓝色色素之间选择具有最低背景色的层。
（6）用传送的方法彻底沉积并漫长地擦拭NBT/BCIP缓冲液，直到粉末溶解为止。
（7）大约等待2-5分钟，直到染色溶液中的条纹清晰可见，然后将印迹膜用冷水淋浴2-3次，以停止染色反应。
5.结果分析
（1）用蛋白印迹图清晰地描述蛋白质。
（2）对印迹膜进行相应的验量和图像分析，以便将结果可视化，从而更好地了解结果。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
Western blot 蛋白印迹 操作规程 操作步骤
蛋白印迹技术(Western blotting)印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。
毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片硝酸纤维素膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。
缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。
这个过程持续过夜，就可以将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
但这种方法转移的效率较低，通常只能转移凝胶中一小部分蛋白质（10％～20％）。
电泳印迹可以更快速有效的进行转移。
这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成"三明治"形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。
转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进 一步检测。
印迹首先用蛋白溶液（如10％的BSA）处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。
处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗是抗鼠Ig G的抗体。
蛋白质印迹(Western blotting)
蛋白质印迹(Western blotting)一、实验目的：免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。
二、实验原理：蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。
蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，强度比较差，需要从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。
3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。
4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。
5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。
三、试剂与器材：试剂:(1)人IgG免疫兔的抗血清；(2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；(3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4；(4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20；(5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；(6)底物溶液：A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml 一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202；(7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
蛋白质印记实验流程
蛋白质印记实验流程
蛋白质印记实验是一种常用的生物化学实验，用于研究蛋白质
的结构和功能。
下面将介绍一般的蛋白质印记实验流程。
1. 提取蛋白质样品，首先需要从细胞或组织中提取蛋白质样品。
这可以通过细胞裂解和离心来实现。
裂解后的细胞溶液中含有各种
蛋白质，可以用于后续的实验操作。
2. SDS-PAGE电泳，将提取的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶
电泳（SDS-PAGE）凝胶槽中，通过电泳分离蛋白质。
SDS-PAGE可以
根据蛋白质的分子量将蛋白质分离成不同的条带，方便后续的实验
操作。
3. 转印，将SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺
膜上，这个步骤称为印迹。
通过印迹，可以将蛋白质从凝胶中转移
到膜上，便于后续的免疫检测。
4. 免疫检测，在印迹膜上进行免疫检测，通常使用特异性抗体
与目标蛋白质结合，然后通过化学发光或染色等方法来检测蛋白质
的存在和含量。
5. 分析和图像，最后，通过分析免疫检测的结果，可以得到目标蛋白质的信息，包括其分子量、含量和可能的修饰情况。
通常会使用影像系统拍摄印迹膜的图像，以便于后续的数据分析和记录。
以上就是一般的蛋白质印记实验流程，通过这些步骤可以对特定蛋白质进行检测和分析，为后续的研究提供重要的信息。
蛋白质印迹法的步骤是什么呢？
蛋白质印迹法的步骤是什么呢？
显色或放射自显影以检测。
二、分类
Western Blot显色的方法主要有以下几种：
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表。
三、样品制备
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取：
2. 组织中总蛋白的提取：
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取。
蛋白质印迹法，一种找出基因表达错误引起的疾病的方法。
这种快速能找的导致疾病的抗原，并且特异性抗体（一种蛋白质）被着色的优势，在研究遗传疾病，基因问题，疾病的检测上运用很多。
在其制作的基础上，也在不断发展出新的检测技术，如Southern Blot杂交方法。
蛋白印迹
蛋白质印迹法一.原理：Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体【例如硝酸纤维素薄膜（nc膜）】上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
二. 步骤：1.制胶（1）将清洁干净的玻璃板对齐后放入架中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（（2）分离胶制法：先将所需量的蒸馏水、30% AcrBis(29:1)、1 MTris,PH8.8、10%SDS、依次加入离心管中，进行摇匀，再将所需量的10%过硫酸铵、TEMED加入，再次进行摇匀(注：要充分摇匀)。
然后用1ml的微量加样器进行灌胶，灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度，待胶面升到接触绿带高度时即可，然后将板内气泡赶至顶部，再在胶上加一层水进行液封并置于恒温箱内，约20分钟即凝固。
待分离胶凝固后倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干再配制浓缩胶。
（注：操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形。
1.0mm板每板大约需5ml分离胶，1.5mm板每板大约需8ml分离胶）。
（3）浓缩胶制法：先将所需量的蒸馏水、30% AcrBis(29:1)、1 MTris,PH6.8、10%SDS、依次加入离心管中，然后进行摇匀，再将所需量的10%过硫酸铵、TEMED加入，再次进行摇匀。
然后用1ml的微量加样器进行灌胶，待胶面升到玻璃板上端时即可，再将梳子插入浓缩胶中，梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，待浓缩胶凝固约30分钟中后冷却至室温即可用于电泳。
（1.0mm板每板大约需1.5ml浓缩胶，1.5mm板每板大约需2ml浓缩胶）。
蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤
蛋白质印迹分析实验原理与操作步骤蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这就是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质得免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以就是粗提物也可以经过一定得分离与纯化,另外这项技术得应用需要利用待测蛋白得单克隆或多克隆抗体进行识别。
关键词:印迹蛋白质步骤蛋白质印迹分析蛋白质印迹Westernｂlottinｇimmunoblotｔiｎg免疫印迹法蛋白质印迹法【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这就是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质得免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以就是粗提物也可以经过一定得分离与纯化,另外这项技术得应用需要利用待测蛋白得单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示,可溶性抗原,也就就是待测蛋白首先要根据其性质,如分子量,分子大小,电荷以及其等电点等采用不同得电泳方法进行分离;通过电流将凝胶中得蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上;利用抗体(一抗)与抗原发生特异性结合得原理,以抗体作为探针钓取目得蛋白。
值得注意得就是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白,如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜得非特异性结合。
经电泳分离后得蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常用得两种电转移方法分别为:１。
半干法: 凝胶与固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿得滤纸之间,通电时间为1０分钟~３０分钟。
2.湿法:凝胶与固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中,转移时间可从45分钟延长到过夜进行、由于湿法得使用弹性更大并且没有明显浪费更多得时间与原料,因此我们在这里只描述湿法得基本操作过程。
对于目得蛋白得识别需要采用能够识别一抗得第二抗体。
该抗体往往就是购买得成品,已经被结合或标记了特定得试剂,如辣根过氧化物酶。
这种标记就是利用辣根过氧化物酶所催化得一个比色反应,该反应得产物有特定得颜色且固定在固相载体上,容易鉴别。
因此可通过对二抗得识别而识别一抗,进而判断出目标蛋白所在得位置。
其她得识别系统包括碱性磷酸酶系统与125I标记系统、1。
蛋白质印记实验流程
蛋白质印记实验流程
蛋白质印记实验是一种常用的生物化学技术，用于研究蛋白质
的结构、功能和相互作用。
下面将介绍一般的蛋白质印记实验流程。
1. 细胞培养和蛋白质提取。
首先，需要培养所需的细胞系，并收集细胞。
然后，用细胞裂
解液裂解细胞膜，释放蛋白质。
接着，通过超速离心将裂解液离心，以获得上清液中的蛋白质。
2. 免疫沉淀。
将待测蛋白质上清液与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，使用蛋白A/G琼脂糖或其他亲和层析介质进行免疫沉淀，将
抗原-抗体复合物沉淀下来。
3. SDS-PAGE电泳。
将免疫沉淀得到的蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离。
SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小进行分离，从而得到不同的蛋白质
条带。
4. 免疫印迹分析。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质迁移到聚丙烯膜或硝酸纤维膜上，形成蛋白质印记。
然后，使用特异性抗体结合目标蛋白质，通过化学发光或染色方法检测蛋白质印记。
5. 数据分析。
最后，根据免疫印迹结果，分析蛋白质的表达水平、分子量和相互作用等信息。
通过比较不同样品的免疫印迹结果，可以得出对蛋白质的定量和定性分析。
总结，蛋白质印记实验流程包括细胞培养和蛋白质提取、免疫沉淀、SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析和数据分析等步骤。
这一流程可以帮助研究人员深入了解蛋白质的结构和功能，为生物医学研究提供重要的实验数据。
蛋白印迹操作流程
蛋白印迹操作流程蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，简称WB，是用免疫学方法检测蛋白，研究蛋白质的表达调控的重要方法之一。
蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
1.蛋白样品的制备(Protein sample preparation)可以选用适当的裂解液，如赛驰生产的WIP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，如赛驰生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。
蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。
如使用我公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)(1)SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2)样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，放置于水漂上于100℃或沸水浴中加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。
蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
(3) 上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可电泳，电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白电泳缓冲液(10X)。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
蛋白质印迹技术原理与操作流程Western blot
概念
蛋白质印迹是一种综合性的免疫学检测技术。 ①电泳：它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质 分子按分子量大小在凝胶上分离开 ②转膜：然后利用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上 ③抗体孵育：以固相膜上的蛋白质作为抗原，与对应抗 体结合 ④显影：经过底物显色或荧光成像等方法以检测电泳分 离的特异性目的基因表达的蛋白质。
电泳前准备-放入电泳槽
放入电泳槽中
电泳前准备-加电泳液
向内槽中加电泳液，如果不漏，再向外槽中加电泳液；如果漏液，则要重新把 玻板插好，使内外不交通。电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板，继续加把气泡 冲走。
电泳前准备-上样
从-20℃冰箱取出蛋白样品（加入5×上样缓冲液和5min沸水处理后），室温融化，上 样前涡旋均匀，通过计算好的蛋白上样量进行上样（提取蛋白时测浓度，计算上样体 积），上样体积一般不超过15ul（上样不能太快，否则样品会冲出加样孔），每加一 次样更换一次枪头。 Marker每孔加2-5ul
电泳前准备-上样
电泳
恒压： 浓缩胶电泳：80V 30min 分离胶电泳：120V 70min
电泳
转膜前准备-配转膜液
配制转膜液，先不加甲醇，待转膜接电源前加入（甲醇易挥发） 将转膜液倒入一部分于搪瓷盘中，准备切胶（保持胶湿润）
转膜前准备-剪膜
PVDF膜：蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物，分子量大于20000的蛋白选 用0.45um的膜，小于20000的蛋白选用0.2um的膜。使用前需用甲醇 浸润片刻，目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白 结合。
作用（易挥发，强神经毒性）
H20 Tris·HCL Glycine(甘氨酸) SDS
电泳液
400ml 1.2g 5.8g 0.4g
蛋白印记操作流程
蛋白印记操作流程
蛋白印记（WesternBlot）是一种常用的生物学实验技术，主要用于检测和分析蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
以下是蛋白印记的基本操作流程：
样品制备：首先，从细胞或组织中提取蛋白质。
对于细胞样品，通常需要将细胞破碎并溶解在裂解液中。
对于组织样品，可能需要将组织切成小块并加入预冷的裂解液进行匀浆。
然后，通过离心去除细胞碎片或未溶解的组织残渣，收集上清液作为蛋白质样品。
蛋白质定量：接着，对提取的蛋白质进行定量。
这可以通过使用蛋白质定量试剂盒或分光光度计等方法来完成。
蛋白质定量的准确性对于后续的实验步骤至关重要。
SDS-PAGE电泳：将定量后的蛋白质样品与SDS-PAGE上样缓冲液混合，并在一定温度下预热。
然后，将样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
电泳过程中，蛋白质会根据其分子量大小在凝胶中分离。
转膜：电泳结束后，将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜上。
这一步通常通过电泳或真空转移法完成。
免疫检测：转膜后，使用特定的抗体与膜上的蛋白质进行免疫反应。
这通常包括一抗孵育、洗涤、二抗孵育和再次洗涤等步骤。
一抗是针对目标蛋白质的特异性抗体，而二抗则是与一抗结合的标记抗体，用于后续的显色反应。
显色与结果分析：最后，通过显色反应（如化学发光或荧光检测）来可视化抗体与蛋白质的结合情况。
根据显色结果，可以分析目标蛋白质在样品中的表达水平和分布情况。
整个操作流程需要严格遵循实验规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，还需要注意实验过程中的安全事项，如佩戴防护眼镜和手套等。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白印迹操作流程
蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western
印迹，简称WB，是用免疫学方法检测蛋白，研究蛋白质的表达调控
的重要方法之一。
蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
1.蛋白样品的制备(Protein sample preparation)
可以选用适当的裂解液，如赛驰生产的WIP细胞裂解液，裂解贴壁
细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如
细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这
些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，如赛驰生产的细胞
核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定其
蛋白浓度。
蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用
的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度
测定方法的影响差别很大。
如使用我公司生产的WIP细胞裂解液，
可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1)SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制，也可以使用赛驰生
产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。
该试剂盒提供了除水和配胶器具
外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2)样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，放置于水漂上于100℃或沸水浴中加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。
蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
(3) 上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可电泳，电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白电泳缓冲液(10X)。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。
采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求，也可以采用赛驰提供的多功能电泳仪。
为方便起见，也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定时间为90－120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
在Western实验中，我们推荐选用PVDF膜，也可以使用硝酸纤维素膜(NC膜)，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
膜的使用请参考生产商推荐的使用步骤。
转膜时，通常可使用赛驰提供的多功能电泳仪。
转膜电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的蛋白印迹转膜电泳缓冲液(10X)。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转膜电流可设定为300-400mA，转膜时间为30-60分钟或15-20mA于4℃转膜过夜。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE 胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的WB洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。
从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
为减少液体使用量，避免干膜，您可以选用赛驰生物提供的杂交袋进行后续操作，可用巴斯特吸管吸尽洗涤液，加入WB封闭液，在摇床上
缓慢摇动,室温封闭60分钟。
如背景较高，可以在4℃封闭过夜。
在整个Western过程中可使用侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。
用巴斯特吸管吸尽封闭液，不要漂洗，直接加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。
回收一抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。
如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
用巴斯特吸管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。
如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
检测结果可使用DAB染色试剂或氯萘酚染色试剂来检测蛋白，具体使用细节请参考赛驰生物相关产品说明书.
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用WB抗体去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。