农杆菌转化

植物表达载体转化农杆菌操作步骤

第一部分：农杆菌介导转化水稻

1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101

2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。28℃培养。

3、农杆菌感受态细胞的制备：

1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。

2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；

3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；

4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；

5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；

6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；

制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。

4、DNA直接转化农杆菌：

1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；

2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；

3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；

4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。

（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）

5、重组农杆菌鉴定：

1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。

（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）

2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml 或10mg/ml）。

3）质粒酶切或PCR鉴定。

6、三亲交配法：

参考一：

1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养；

（pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养；

3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养；

4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养；

5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜；

6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）

7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28℃培养至长出单菌落；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）

8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养；

9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。

10）将阳性单菌落再次划线纯化。

三亲交配法：

参考二：

1)从保存根癌农杆菌LBA4404的平板上挑取一个单菌落，接种于10m1不含

抗生素的LB液体培养基中，28℃, 200rpm培养24h;

2)从保存中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB

液体培养基中，37℃，250rpm培养约8h;

3)从保存辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗

生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm培养约8h;

4)分别取以上三种细菌培养物50u1于1.5m1离心管中混匀，取100u!涂布于

无抗生素的LB平板上，28℃培养过夜;

5)用接种环将长出的菌落转接到含有Kan 50ug/ml,Str 25ug/ml和Rif 25ug/ml的LB平板上，28℃培养过夜;同时各取1, 2, 3步骤中的菌液100u}分别涂布于含

有三种抗生素的LB平板上，作为对照。

注意一、农杆菌提取质粒，拷贝数较低，很难用酶切鉴定的方法鉴别。因此一般用PCR鉴定。（PCR鉴定时要做好阴性对照。一般以未带有目的基因的空载体和未经转化的空农杆菌做对照）。另外，未完善起见，可做回转化：即将农杆菌中提取的质粒电泳和PCR鉴定后，再将其回转到大肠杆菌中，再提取质粒酶切鉴定。

注意二、LBA4404为利福平和链霉素抗性，EHA105为利福平抗性，pRK2013为Kan抗性注意三、

1）、利福平，溶于甲醇或氢氧化钠溶解后无菌蒸馏水定容，贮液20mg/ml，-20保存三个月，使用浓度50~100L。

2）、利福平(Rif)先用少量无水乙醇溶解，最后用无菌水配成50mg/ml的母液，过滤灭菌。3）、利福平用甲醇配成浓度为20mg/ml，于－20度保存。工作浓度50ug/ml

4）、链霉素用水融解至浓度为10 mg/ml后于－20度保存。工作浓度50ug/ml

5）、溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

抗生素储存液工作浓度

浓度(mg/ml) 保存条件严紧型质粒(μg/ml)松弛型质粒(μg/ml)

氨苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60

羧苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60

氯霉素 34 (溶于乙醇) -20℃ 25 170

卡那霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50

链霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50

四环素 5 (溶于乙醇) -20℃ 10 50

7、水稻胚性愈伤组织的诱导

取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min（或75％酒精浸泡1min），再于0.1%升汞中浸泡15min（或再转入20％的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min），超净工作台中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导