病原生物学实验一

消毒与灭菌方法
加热灭菌
干热灭菌 湿热灭菌
过滤除菌 辐射灭菌
放射线辐照灭菌 紫外线灭菌
化学消毒剂
Байду номын сангаас 干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变 性而达到灭菌的目的。
干热灭菌有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。
细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。在菌体受热
时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越
基础培养基
营养培养基（加富培养基）
鉴别培养基：含有特定化合物或试剂。某种微生物在这种 培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的 化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特 征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。 选择培养基：利用微生物对某种化学物质的敏感性不同， 在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而 利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微 生物的目的。
•
此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质
的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于
实验室中小量溶液的过滤除菌。
紫外线灭菌
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200~300 nm的紫 外线都有杀菌能力，其中以265-266nm的杀菌力最强。
紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。所以，只适用于无菌
快，反之凝固缓慢。 因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高 （160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温 度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦， 甚至引起燃烧。
高压蒸汽灭菌法
压力：1.05kg/cm2 或103.425KPa 温度: 121.3℃ 时间：15-20min
病原生物学实验室规则
• 学生进病原生物学实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折， 要经常清洗消毒。 • 进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定 的储物柜内。 • 严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。 • 手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手； 避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。 • 实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料要 扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫 卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。
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倒 平 板 操 作 示 意 图
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6．无菌检验：
随机抽取几个平板或试管培养基于温箱中培养
24小时，若无菌 生长则为合格。
7．备用：
将合格的平板培养基 和试管培养基放入冰箱，
在0-4℃中保存备用。
（二）SS琼脂培养基
按比例称取SS琼脂粉，溶解后灭菌，无 菌倾注平皿制成平板。 常用于沙门氏及志贺氏菌的分离。
消毒与灭菌
消毒是一般指采用物理、化学和生物的方法消除物体的 表面病原菌和有害微生物营养体的过程。 灭菌则是指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生 物的营养体、芽孢和孢子的过程。
在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污
染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格
的消毒和灭菌。
仪器材料
☆ 高压蒸气灭菌器、电热干燥箱、电炉、
天平、量筒、漏斗、试管、培养皿、烧杯、 三角烧瓶、 ☆ 营养琼脂培养基、SS琼脂培养基、营养
肉汤培养基、琼脂等
方法步骤
（一）营养琼脂培养基 （二）SS琼脂培养基 （三）液体培养基
（四）半固体培养基
（一）营养琼脂培养基
• 计算
•
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称量
溶化
•
• • •
实验室意外紧急处理办法
1 皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后2%碘酊或2%红 汞涂抹。 2 烧伤：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。 3 化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠 溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用 2%硼酸洗涤中 和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡1~2滴滴眼）。 4 菌液入口：立即吐入消毒容器内，1：1000高锰酸钾或3%双氧 水漱口，根据菌种服用抗菌药物。 5 菌液污染台面：2%~3%来苏尔或0.1%新洁尔灭覆盖30分钟后抹 去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡 3分后肥皂和清水洗净。 6 火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机 溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。
性的观察和保存菌种。
（四）半固体培养基
肉汤培养基中加入 0.3% ～0.5%琼脂粉制成，
用于菌种的保存或观察细菌的运动性。
实验操作内容
• 营养琼脂培养基 600ml（营养琼脂19.2g），分装2个三角 瓶每瓶300ml，其中1瓶加热融化后分装 10支斜面，每管6ml 。 • 半固体培养基 100ml（肉汤粉3g+琼脂粉0.5g）， 加热融化后分装至10支试管，每管6ml 。 • 液体培养基 100ml（肉汤粉3g）， 混匀后直接分装至10支试管，每管6ml。 • SS培养基 200ml（SS琼脂12.4g） 混匀后直接灭菌。
一定的氧化还原电位； 合适的渗透压。
培养基的分类
根据微生物的种类和实验目的的不同，培养 基分类可以按以下方式： 1. 按成分的不同分 2. 按培养基的物理状态分 3. 按培养基的用途分
按照培养基的成分来分：
天然培养基:主要成分是复杂的天然有机物质
合成培养基:用化学成分完全了解的纯化合物药
常用培养基的制备
实验目的
• • 掌握制备常用的培养基的制备方法 熟悉培养基制备的基本程序
实验原理
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累 代谢产物的营养基质。 人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个 良好的营养条件。
培养基配制要素
营养：碳源、氮源、能源、生长因子、水分和无 机盐； 适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力；
倒平板或倒试管
灭菌 无菌检验 备用
1．计算：
根据营养琼脂培养基的说明书了解营养琼脂粉与水的比 例，一般是1000 ml蒸馏水中应加营养琼脂粉32g，再根据培 养基的需要量确定营养琼脂粉的用量。 营养琼脂粉的量=31.3×15×n/1000 （g） 其中： 15代表一个平板需要营养琼脂约15 ml； n代表要做的培养基平板的数量
品配制而成的培养基
半合成培养基:以天然有机物作为微生物营养来
源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品
所配制的培养基
按照培养基的物理状态：
固体培养基：加入凝固剂，如1.5% ~ 2.0%
琼脂
半固体培养基：加入少量凝固剂，如 0.2% ~
0.7%琼脂
液体培养基：不含任何凝固剂
按照培养基的用途：
病原生物学实验一
病原生物学教研室 sqjcbwm@126.com 郝振华
主要内容
生物安全
培养基的制备 消毒灭菌
生物安全
P4实验室
P3实验室
P2实验室
P1实验室
操作能够引起人类或者动物非常严重疾 病的微生物，尚无有效预防或治疗方法 操作能够引起人类或者动物严重疾病，比 较容易直接或者间接在人与人、动物与人、 动物与动物间传播的微生物 操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况 下对人、动物或者环境不构成严重危害 操作在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的 微生物
室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线 灯距照射物以不超过1.2m为宜。 杀菌机制：引起DNA链上相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而 干扰DNA的复制和转录，导致细菌死亡。
3.化学消毒剂对细菌的影响
• 有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物， 称为化学消毒剂； • 浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂；
2．称量：
用普通天平准确称量出营养琼脂粉的量，用量筒量 出相应的 蒸馏水的量，要尽量准确。
3．溶化：
将营养琼脂粉和蒸馏水倒入搪瓷缸中，于电炉上加热 溶化，边加热边搅拌，沸腾时立即从电炉上拿下，等泡 沫消失后再放在电炉上加热，注意不能让琼脂溢出，煮 沸2—3次。
4．试管分装：
• 若做斜面培养基应倒入试管
（三）肉汤培养基
1 ．成分 牛肉膏 3 ～ 5g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，蒸馏水
1000ml。 2．制法 将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠加蒸馏水后，加热溶解。 矫正 pH 至 7.4 ～ 7.6 ，过滤分装。置高压蒸气灭菌器内， 121.3℃灭菌20min即成。 3．用途 可供一般细菌生长，同时也是制作一般培养基的基 础原料。供营养要求较高的细菌分离培养，亦可供溶血
中，量为试管的1/3。
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分装过程中，注意不要使培 养基沾在管（瓶）口上以免 污染棉塞而引起污染。
5．灭菌：用高压灭菌器灭菌
将三角瓶、试管口盖上 棉塞或橡胶塞，用纸包扎好， 直 立 放 入 内 筒 中 ， 在 121.3℃灭菌20-30min。 灭菌完毕后，将三角瓶 中的培养基无菌倒入平皿内 制成平板，凝固前勿动；将 试管培养基摆成斜面，凝固 前勿动。
• 只能外用，对细菌的敏感性不同。
下次实验内容
• 细菌接种技术 • 细菌的分布 • 肠道致病菌的分离与鉴定（1）
注意：下次实验需学生自备粪便标本
完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢
注意事项
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锅内物品不宜过紧。
注意排出冷气，否则气压表虽已达15磅，温度 达不到121.3℃，不能保证灭菌效果。
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灭菌后排气不能过急，以免容器内液体外溢或 引起破裂。
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不耐高热高压之物品，不能用此法。
过滤除菌
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过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的 方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。