生化实验三--果蔬中蛋白质含量测定

三,实验器材
1,可见光分光光度计 , 2,旋涡混合器 , 3,试管16支 ,试管 支
四,实验试剂
1,标准蛋白质溶液——牛血清清蛋白 ,标准蛋白质溶液 牛血清清蛋白(bsa): 牛血清清蛋白 : 配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的标准蛋白质溶液. / 的标准蛋白质溶液. 配制成 和 / 的标准蛋白质溶液 2,考马斯亮兰G-250染料试剂: ,考马斯亮兰 染料试剂: 染料试剂 称100mg考马斯亮兰 考马斯亮兰G-250,溶于 考马斯亮兰 ,溶于50mL 95%的乙醇 的乙醇 的磷酸, 后,再加入120mL 85%的磷酸,用水稀释至 . 再加入 的磷酸 用水稀释至1L. 3,0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) , 缓冲液( / 缓冲液 ) 4,各种果蔬 ,
迅速混匀, ～ ℃ 或室温下) 迅速混匀 , 20～ 25℃ ( 或室温下 ) 放置 30min, 用分光光度计 , 在波长 , 用分光光度计,在波长500nm下 , 以 下 号管调零, "0"号管调零,测定各管吸光度 号管调零
六,结果处理
根据测定管吸光度, 根据测定管吸光度,在标准曲线上查出对 应的标准蛋白质的浓度, 再乘以稀释倍数, 应的标准蛋白质的浓度 , 再乘以稀释倍数 , 即为每克鲜果蔬中蛋白质的微克数. 即为每克鲜果蔬中蛋白质的微克数.
注意事项: 注意事项:
如果测定要求很严格, ⑴ , 如果测定要求很严格 , 可以在试剂加入后的 5～ 20min内测定光吸收 , 因为在这段时间内颜色 ～ 内测定光吸收, 内测定光吸收 是最稳定的.比色反应需在 内完成 内完成. 是最稳定的.比色反应需在1h内完成. 测定中, 蛋白-染料复合物会有少部分吸附于 ⑵ , 测定中 , 蛋白 染料复合物会有少部分吸附于 比色杯壁上, 比色杯壁上,实验证明此复合物的吸附量是可以忽 略的.不可使用石英比色皿(因不易洗去染色) 略的.不可使用石英比色皿(因不易洗去染色), 可用塑料或玻璃比色皿,测定完后可用95%的乙醇 可用塑料或玻璃比色皿,测定完后可用 的乙醇 将蓝色的比色杯洗干净. 将蓝色的比色杯洗干净.
2,乙试剂: ,乙试剂: 磨口回流装置中加入100g钨酸钠 , 25g钼 钨酸钠, 在 2L磨口回流装置中加入 磨口回流装置中加入 钨酸钠 钼 酸钠及700mL蒸馏水 , 再加入 蒸馏水 再加入50mL 85%磷酸及 酸钠及 磷酸及 100mL浓HCl,充分混合后用小火回流 小时 . 回 小时. 浓 , 充分混合后用小火回流10小时 流完毕冷却后, 加入150g锂 , 50mL蒸馏水及液体 流完毕冷却后 , 加入 锂 蒸馏水及液体 溴数滴,摇匀后再开口沸腾15分钟 以驱逐过量溴. 分钟, 溴数滴,摇匀后再开口沸腾 分钟,以驱逐过量溴. 溶液冷却后稀释至1000mL, 溶液呈透明淡黄色 , , 溶液呈透明淡黄色, 溶液冷却后稀释至 置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存. 置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存. 使用前用标准NaOH溶液标定 , 以酚酞为指示 溶液标定, 使用前用标准 溶液标定 标定其酸度为1 剂 , 标定其酸度为 mol/L,此为乙试剂应用液 , / , 此为乙试剂应用液, 置冰箱中可长期保存. 置冰箱中可长期保存.
加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后 , 摇 蛋白试剂后, 加入考马斯亮蓝 蛋白试剂后 放置2min后, 在 595nm波长下比色测定, 波长下比色测定, 匀 , 放置 后 波长下比色测定 记录A 记录 595. 以各管相应标准蛋白质含量( ) 以各管相应标准蛋白质含量 ( g)为横 坐标, 坐标,A595为纵坐标,绘制标准曲线. 为纵坐标,绘制标准曲线.
生物化学实验 第一部分 果蔬成分的生化分析
综合实验一:
果蔬成分的生化分析
果蔬中维生素C的定量测定 的定量测定( 学时 学时) 实验一 果蔬中维生素 的定量测定(4学时) 果蔬中总糖及还原糖含量的测定( 学时 学时) 实验二 果蔬中总糖及还原糖含量的测定(4学时) 果蔬中蛋白质含量的测定( 学时 学时) 实验三 果蔬中蛋白质含量的测定(4学时) 果蔬中过氧化物酶分析( 学时 学时) 实验四 果蔬中过氧化物酶分析(12学时)
注意事项: 注意事项:
1,Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定,在加入到碱 , 酚试剂在酸性条件下较稳定, 酚试剂在酸性条件下较稳定 性的铜离子-蛋白质溶液中时( 约 ) 性的铜离子 蛋白质溶液中时(pH约10),必须立 蛋白质溶液中时 即混匀,以便在磷钼酸,磷钨酸试剂破坏之前, 即混匀,以便在磷钼酸,磷钨酸试剂破坏之前,即 发生还原反应. 发生还原反应. 2,本法受多种因素干扰 , 凡对双缩脲反应起干扰 , 本法受多种因素干扰, 作用的基团以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲液均 可干扰Folin-酚反应. 酚反应. 可干扰 酚反应
实验材料: 实验材料:
冬枣+柚子 冬枣+柚子——1～4组 ～ 组 梨(2个品种)——5～8组 个品种) 个品种 ～ 组 盘菜+ 盘菜+萝卜 ——9～12组 ～ 组
实验三
果蔬中蛋白质含量的测定
(考马斯亮蓝法) 考马斯亮蓝法)
一,目的
1,掌握蛋白质测定的方法和技术. ,掌握蛋白质测定的方法和技术. 2,了解果蔬中蛋白质的含量. ,了解果蔬中蛋白质的含量.
五,操作
1,标准曲线绘制: ,标准曲线绘制: 支试管, 取6支试管,按下表加入各试剂. 支试管 按下表加入各试剂.
管号 试剂 100g /mL牛血清白蛋 牛血清白蛋 白溶液/ 白溶液/mL 蒸馏水/ 蒸馏水/mL 考马斯亮蓝液/ 考马斯亮蓝液/mL 1.0 5.0 0.8 5.0 0.6 5.0 0.4 5.0 0.2 5.0 0 5.0 0 0 1 0.2 2 0.4 3 0.6 4 0.8 5 1.0
三,实验器材
1,分光光度计 , 2,电热恒温水浴箱 , 3,试管 , 4,刻度吸管 , 5,试管架 , 6,容量瓶 , 7,坐标纸 , 500mL 15×150mm × 0.5mL,1mL,5mL , ,
四,实验试剂
1,甲试剂: ,甲试剂: 无水碳酸钠, ① : 2g无水碳酸钠 , 加入 无水碳酸钠 加入0.1mol/L氢氧化钠溶液 / 氢氧化钠溶液 100mL混匀; 混匀; 混匀 称取CuSO45H2O 0.5g,加入 ② : 称取 , 加入1%(35mmol/L) ( / ) 酒石酸钾钠溶液100mL,混匀. ,混匀. 酒石酸钾钠溶液 使用前将① 使用前将 ① 与 ② 按 50:1混合即成碱性硫酸铜溶 混合即成碱性硫酸铜溶 混合后,试剂只能使用一天, 液.(混合后,试剂只能使用一天,但碱性溶液和 0.5% CuSO45H2O溶液可分别长期保存) 溶液可分别长期保存) 溶液可分别长期保存
2,样品制备: ,样品制备: 称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内 , 称取 待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内, 待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内 加 入 1mL H2O 或 0.05mol/L Tris-HCl 缓 冲 液 / (pH6.8)研成匀浆,转入离心管,再用 )研成匀浆,转入离心管,再用2mL水或 水或 缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部 缓冲液 将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部 转入离心管, 离心15～ 转入离心管 , 3500rpm离心 ～ 20min,其上清液 离心 , 即为蛋白质提取液,供分析用. 即为蛋白质提取液,供分析用. (注:盘菜,萝卜稀释至10mL) 盘菜,萝卜稀释至 )
五,操作
1,标准曲线绘制: ,标准曲线绘制: 支试管, 取7支试管,按下表加入各试剂. 支试管 按下表加入各试剂.
试剂 0 1 2 3 0.4mL 0.6mL 5.0mL 4 0.6mL 0.4mL 5.0mL 5 0.8mL 0.2mL 5.0mL 6 1.0mL 0.0mL 5.0mL
牛血清 白蛋白 0.0mL 0.1mL 0.2mL 标准液 蒸馏水 1.0mL 0.9mL 0.8mL 甲试剂 5.0mL 5.0mL 5.0mL
二,原理
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色 , 在酸性游离状态下呈棕红色, 考马斯亮蓝 在酸性游离状态下呈棕红色 最大光吸收在465nm,当它与蛋白质结合后变为蓝 , 最大光吸收在 色,最大光吸收在595nm. 最大光吸收在 . 在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质-染料复 在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质 染料复 合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正 处的光吸收与蛋白质含量成正 合物在波长为 比,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结 通过测定 处光吸收的增加量可知与其结 合蛋白质的量. 合蛋白质的量.
3,牛血清白蛋白标准液(200 g/mL): ,牛血清白蛋白标准液( ) 准 确 称 取 牛 血 清 白 蛋 白 粉 末 50.0mg , 用 0.1 mol/L NaOH溶液润湿溶解,加蒸馏水到 / 溶液润湿溶解, 溶液润湿溶解 加蒸馏水到250mL. . 4,0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) , 缓冲液( / 缓冲液 ) 5,各种果蔬 ,
2,样品制备: ,样品制备: 称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内 , 称取 待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内, 待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内 加 入 1mL H2O 或 0.05mol/L Tris-HCl 缓 冲 液 / (pH6.8)研成匀浆,转入离心管,再用 )研成匀浆,转入离心管,再用2mL水或 水或 缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部 缓冲液 将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部 转入离心管, 离心15～ 转入离心管 , 3500rpm离心 ～ 20min,其上清液 离心 , 即为蛋白质提取液,供分析用. 即为蛋白质提取液,供分析用. (注:盘菜,萝卜稀释至10mL) 盘菜,萝卜稀释至 )
3,样品测定: ,样品测定: 只试管编号, 取2只试管编号,按下表加入试剂: 只试管编号 按下表加入试剂:
试剂 蛋白质提取液 蒸馏水 甲试剂 空白管 1.0mL 5.0mL 测定管 1.0mL 5.0mL
混匀, 混匀,于20～25℃(或室温下)放置 ～ ℃ 或室温下)放置10min 乙试剂 0.5mL 0.5mL
3,样品测定: ,样品测定: 试 管 中 加 自 制 蛋 白 质 样 品 1.0mL , 再 加 入 5.0mL考马斯亮蓝 考马斯亮蓝G-250试剂 , 摇匀 , 放置 试剂, 考马斯亮蓝 试剂 摇匀, 放置5min后 , 后 波长下比色, 在595nm波长下比色,记录 595. 波长下比色 记录A 根据所测A 从标准曲线上查得蛋白质含量. 根据所测 595从标准曲线上查得蛋白质含量.
混匀, 混匀,于20～25℃(或室温下)放置 ～ ℃ 或室温下)放置10min 乙试剂 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
迅速混匀, ～ ℃ 或室温下) 迅速混匀 , 20～25℃( 或室温下 ) 放置 30mห้องสมุดไป่ตู้n, 用分光光度计 , 在波长 , 用分光光度计, 在波长500nm下 , 下 号管调零, 以"0"号管调零,测定各管吸光度. 号管调零 测定各管吸光度. 以各管吸光度为纵坐标, 以各管吸光度为纵坐标 , 各标准蛋白浓 度为横坐标,绘制标准曲线. 度为横坐标,绘制标准曲线.
实验三
果蔬中蛋白质含量的测定
(Folin-酚试剂法 ) 酚试剂法
一,目的
1,掌握蛋白质测定的方法和技术. ,掌握蛋白质测定的方法和技术. 2,了解果蔬中蛋白质的含量. ,了解果蔬中蛋白质的含量.
二,原理
Folin- 酚试剂法是双缩脲法的发展. Folin- 酚试剂法是双缩脲法的发展 . 其试剂 由甲,乙两部分组成.甲试剂相当于双缩脲试剂, 由甲,乙两部分组成.甲试剂相当于双缩脲试剂, 可与肽键起呈色反应. 乙试剂( Folin- 酚试剂) 可与肽键起呈色反应 . 乙试剂 ( 即 Folin- 酚试剂 ) 在碱性条件下极不稳定, 在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原而 呈蓝色(钼蓝和钨兰的混合物) 呈蓝色(钼蓝和钨兰的混合物),其颜色深浅与 蛋白质的含量成正比, 蛋白质的含量成正比,因此通过比色可测定蛋白 质的浓度. 质的浓度. 本方法最大的优点是灵敏度高, 本方法最大的优点是灵敏度高,比双缩脲法 灵敏100倍,较紫外分光光度法灵敏10～20倍. 倍 较紫外分光光度法灵敏 ～ 倍 灵敏