elisa检测抗体效价
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实验目的：
实验材料：
1、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、浓硫酸、Tween-20 、BSA等。
2、酶标抗小鼠IgG
3、TMB
溶液配制：
1、抗原包被液：PH9.6的碳酸盐缓冲液（0.05 M）批号：
称取：
Na2CO3（分子量105.99） 1.59 g
NaHCO3（分子量84.01） 2.9 g
加蒸馏水至1000ml，调PH值。滤膜（0.45 μm）过滤，4℃保存。
2、洗涤缓冲液(PBS-T) 批号：
PBS缓冲液1000 ml
Tween-20: 0.5 ml
调PH值至7.39。滤膜（0.45 μm）过滤，室温保存或4℃保存。
3、封闭液（1.0% BSA/PBS-T）批号：
洗涤缓冲液1000 ml
BSA: 10 g
现用现配。
4、血清稀释液(pH7.4 PBS)：0.0067 M(PO4+)
5、洗涤用PBS (pH7.4), 0.15 M(PO4+) 批号：
称取：
NaCl8.0 g
Na2HPO4·12H2O 2.9 g
KH2PO40.2 g
KCl0.2 g
加蒸馏水至1000 ml，调PH值至7.39。滤膜（0.45 μm）过滤，室温或4℃保存。
6、二抗稀释液：同洗涤缓冲液
7、终止液：2M H2SO4批号：
水90ml
浓硫酸10.64ml
浓硫酸逐滴加入水中，不断搅拌，防止局部过热。4℃保存。
实验器材：
1、1 ml枪头；200 μl枪头；10 μl枪头，。
2、1.5 ml EP管。
3、移液器1 ml、200 μl、100 μl、20 μl、10 μl、2 μl。
4、96孔板（costor，美国）。
5、电子天枰。
6、酶标仪（Labsystems DragonMK3，芬兰）。
7、洗板机（BIORAD MODEL 1575，美国）。
8、电子pH计（SevenEasy S20）。
方法步骤：
1 包被抗原：
用μg/ml 的蛋白包被，每孔100μl。密封，4℃过夜。
2 洗板：
取出预先4℃包被过夜的96孔板，用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。
3 封闭：
每孔加入封闭液300 μl/孔。封膜，37℃放置1 h。
5 洗板：
用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。
6 加一抗：
96孔板上血清稀释倍数为1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，共8个稀释梯度，具体操作如下：
血清在Ep管中稀释成100倍：
1：10 ： 5 μl原倍血清+ 45 μl血清稀释液；
1：100 ：30 μl10 倍血清+ 270 μl血清稀释液；
按设计加入96孔板相应位置，然后依次按倍比稀释至200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍：
1：400 ：100 μl 200 倍血清+ 100 μl血清稀释液；
1：800 ：100 μl 400 倍血清+ 100 μl血清稀释液；
1：1600 ：100 μl 800 倍血清+ 100 μl血清稀释液；
1：3200 ：100 μl 1600倍血清+ 100 μl血清稀释液；
1：6400 ：100 μl 3200倍血清+ 100 μl血清稀释液；
1：12800 ：100 μl 6400倍血清+ 100 μl血清稀释液；
所有样本加完后，封膜，37℃放置1 h。
7 洗板：
用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。
8 加酶标二抗：
酶标抗小鼠IgG稀释5000倍：
稀释过的酶标二抗液100 μl/孔，封膜，37℃放置1 h。
9 洗板：
用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。
10 底物显色：
底物显色液TMB直接使用，注意避光放置。100 μl/孔，37℃避光放置，约10-20分钟。
11 终止反应：
终止液2 M H2SO4，100 μl/孔。
12 测OD值：
5 min内在酶标仪上震荡后读数，检测波长450 nm。