外源基因在酵母菌中的表达
酵母表达外源蛋白(foreign protein)(1)
酵母表达外源蛋白（foreign protein）（1）1、菌株用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。
2、温度：在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。
3、pH手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。
BMMY的pH7.0-7.5比较合适。
国内外做的最好的rHSA，最适pH大概 5-6左右。
pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。
4、偏爱密码子codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。
密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。
比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。
5、表达时间与空质粒转化对照诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。
最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。
6、污染每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1m l，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。
污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。
加盖报纸后，就再没遇到过污染。
如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml 三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。
7、不表达蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。
8、表达量30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。
酵母表达(1)
酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。
酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。
本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。
原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。
通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。
1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。
2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。
3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。
2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。
3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。
4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。
应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。
2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。
3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。
4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。
5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
甲醇酵母系统表达的影响因素
酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。
了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析基因表达的规律有重要意义，也可为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。
如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。
解决这一问题的方法有2种：一是通过点突变的方法用同义高利用率密码子替代低利用密码子而不改变氨基酸序列；另一方法是截取基因中影响其生物活性的部分。
目前，这些方法在甲醇酵母表达系统中都能提高表达水平。
外源蛋白的空间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌型表达方式。
外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。
2、表达框的染色体整合位点和方式虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。
整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。
AOX1和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase，HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。
Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。
这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。
因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。
3、宿主的甲基营养表型：Mut+或Muts用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。
aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。
基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达
c. 启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响
研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的 表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考 虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就 近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大 量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目 的基因的表达效率。
影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素
1.目的基因的特性 2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数 3.宿主的甲醇利用表型 4.分泌信号 5.产物稳定性 6.翻译后修饰
பைடு நூலகம்
b. 翻译起始序列对表达效率的影响
mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结 合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是 起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就 是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密 码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和 翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位 于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体 RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。 ５’--AGGAGGUXXXAUG--- mRNA ３’AUUCCUCCACUAG----- 16S rRNA3’ 末端
构建表达载体的策略
⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列
的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。 ⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的 基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的 问题。
⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后 面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合 蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降 解，最后可以将融合多肽切除。
3. mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译 工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程； 4. 基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强 子序列存在。
重组法酵母转基因的操作流程
重组法酵母转基因的操作流程1.酵母基因组DNA的提取酵母基因组DNA提取的目的是获取酵母菌体内的DNA用于后续的操作。
一般采用裂解酵母菌体的方法提取DNA，具体步骤如下：-通过酵母预培养，得到酵母菌悬浮液。
-沉淀酵母菌悬浮液，去除培养基。
-使用细胞裂解缓冲液裂解酵母细胞，释放DNA。
-使用丙酮沉淀DNA，去除其他杂质。
-通过洗涤、溶解等步骤得到纯化的酵母基因组DNA。
2.外源DNA的构建外源DNA的构建是将目标基因或其他DNA片段经过特定的操作，构建成可用于转基因的载体DNA。
-针对目标基因，进行PCR扩增或使用其他适当的方法获得目标DNA片段。
-将目标DNA片段与载体DNA进行连接，一般采用限制酶切和DNA连接酶的方法。
-外源DNA还可以构建其他特殊序列，如启动子、标记基因等，以实现特定的目标。
3.酵母菌体的转化转化是将外源DNA导入酵母中，使酵母细胞能够表达外源基因。
酵母菌体转化一般有两种方法：化学法和电转化法。
-化学法转化：-制备酵母靶菌株，包括选择合适的酵母菌株及对应培养基成分的调整。
-制备产生低盐胆固醇溶液和转化缓冲盐溶液。
-稀释酵母导入质粉末，并加入充足的低盐胆固醇溶液。
-在冰上孵育一段时间，将混合液通过热激冷冻的方法转移到电泳气泡中。
-通过勺子串入导入液，冻结导入液后，电泳电环泵注入电泳。
-电泳过程中伴有导入液的减量。
结束电泳时，针尾切割成小片。
-电转化法转化：-将酵母细胞培养至对应的生长期。
-调整酵母细胞浓度。
-准备转化缓冲盐溶液和性相为空凝气泡的溶液。
-将酵母细胞和目标DNA溶液混合。
-通过不同电压的电击法将酵母细胞进行电转化。
-回收转化后的酵母菌体并进行培养。
4.筛选转基因酵母为了筛选出成功转基因的酵母细胞，一般采用标记基因的方法。
-构建一个可表达特定筛选标记基因的转基因酵母菌株。
-将转化后的酵母菌种悬浮液培养在含有选择性的培养基中，使只有转基因酵母能够存活下来。
-通过对菌落进行PCR扩增或其他方法，确认是否成功获得目标基因的酵母菌株。
酵母文库筛选原理
酵母文库筛选原理
酵母文库是一种用于筛选和保存酵母菌株的资源库，它在酵母研究中起着重要的作用。
酵母菌是一种单细胞真菌，常用于生物学和生物工程学中的研究。
酵母文库的原理是通过将酵母菌的基因组片段插入到载体中，然后将载体转化到酵母细胞中，形成一个酵母细胞库。
通过对这个酵母细胞库进行筛选，可以筛选出具有特定性状或功能的酵母菌株。
酵母文库的筛选过程通常分为两个步骤，即初步筛选和深度筛选。
初步筛选是通过对酵母文库进行大规模的筛选，以找到具有所需特性的酵母菌株。
这一步骤通常使用高通量的筛选方法，例如基因芯片或高通量测序技术。
深度筛选是对初步筛选得到的菌株进行进一步的筛选和验证，以确保其具有所需特性的稳定性和可重复性。
酵母文库筛选的原理主要基于酵母菌细胞内的基因组重组和表达机制。
通过将外源基因片段插入酵母基因组中的适当位置，可以实现外源基因的表达。
通过对酵母文库进行筛选，可以找到具有所需特性的酵母菌株，并进一步研究其相关基因的功能和调控机制。
酵母文库筛选的原理虽然简单，但其应用广泛。
在生物医学研究中，酵母文库筛选可用于发现新的药物靶点和治疗方法。
在生物工程学中，酵母文库筛选可用于改良酵母菌的产酶性能，提高其产酶效率。
此外，酵母文库筛选还可用于研究基因的功能和调控机制，进一步揭示生物体内的生物学过程。
总的来说，酵母文库筛选是一种重要的酵母研究工具，通过对酵母菌株进行筛选和保存，可以获得具有特定性状或功能的酵母菌株，为生物学和生物工程学研究提供有力的支持。
酵母文库筛选的原理简单易行，但其应用潜力巨大，将在未来的研究中发挥更加重要的作用。
酵母菌表面展示基因的构建和转化
酵母菌表面展示基因的构建和转化酵母菌表面展示基因是一种常用的蛋白表达技术，通过将外源基因插入酵母菌表面展示基因载体中，使其能够在酵母菌细胞表面表达并展示出来。
这一技术可以应用于酵母菌的蛋白质工程和药物筛选等领域。
本文将介绍酵母菌表面展示基因的构建和转化流程。
一、酵母菌表面展示基因的构建1. 选择适合的酵母菌表面展示基因载体。
常用的载体有pCTCON2、pCTPAS2等，这些载体含有表面展示基因所需的信号序列和适当的启动子。
2. 选择合适的启动子和信号序列。
启动子决定了表达基因的强弱，信号序列决定了基因能否正确的表达在酵母菌细胞表面。
3. 将目标基因插入载体中。
可以使用PCR方法扩增目标基因或通过合成基因片段插入载体中。
注意选择合适的引物设计和错配扩增条件。
4. 确认基因插入正确。
可用酶切鉴定、测序和限制性片段长度多态性（RFLP）分析等方法进行确认。
二、酵母菌表面展示基因的转化1. 构建表达酵母菌表面展示基因的受体菌株。
选择合适的酵母菌株，如Saccharomyces cerevisiae。
构建基因敲除/插入的方法可以用来降低背景信号和增加基因表达效率。
2. 转化酵母菌。
可采用化学转化、电击转化或基因枪等方法。
注意转化体系的优化，如转化时间、转化剂的浓度和pH值等因素。
3. 选择性培养和筛选。
转化后的酵母菌需在含所需选择因子的培养基上进行培养，并去除未转化的酵母菌。
可利用选择性培养基或对抗物质的添加进行筛选。
4. 筛选高表达菌株。
通过检测表面展示蛋白的活性、测定蛋白产量或使用特异性抗体等方法进行筛选。
三、酵母菌表面展示基因的应用1. 酵母细胞表面展示蛋白质工程。
通过酵母菌表面展示基因技术可以进行蛋白质工程研究，可以展示和表达各种蛋白质、抗体、酶、蛋白质片段等物质，以便进行蛋白质相互作用研究、蛋白质功能分析等。
2. 药物筛选。
通过酵母细胞表面展示基因的技术，可以用来筛选化合物对目标蛋白的结合能力、激活能力或抑制能力。
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
选择合适的表达载体构建酵母菌表面展示系统
选择合适的表达载体构建酵母菌表面展示系统酵母菌表面展示系统是一种重要的生物技术工具，它能够使酵母菌表面展示不同的蛋白质、多肽或者抗原，以达到特定的研究目的。
选择合适的表达载体对于构建有效的酵母菌表面展示系统至关重要。
在本回答中，我将介绍选择合适的表达载体的关键因素，并讨论几种常用的表达载体和它们的优缺点。
选择合适的表达载体应考虑以下几个因素：表达载体的来源和类型、可调控性、克隆容量和稳定性。
首先，根据研究需求，可以选择天然酵母表达载体如pYr和pYX，或可自行构建的表达载体如pPICZ。
其次，要考虑表达载体的可调控性，即是否能够实现基因表达的调控，例如通过响应外源诱导剂或温度来控制基因的表达。
此外，克隆容量是个重要因素，因为较大的载体通常能够携带较大的外源基因。
最后，稳定性是指表达载体在酵母细胞中是否容易产生丢失或不稳定，因此选择一个稳定的表达载体可以确保长期高效的基因表达。
在构建酵母菌表面展示系统中，以下是几种常用的表达载体及其优缺点：1. pYr表达载体：pYr是一种基于天然酵母表达载体，能够高效地在酵母菌表面展示外源蛋白。
它具有较高的表达水平和稳定性，并且可以通过改变培养条件控制基因的表达。
另外，pYr载体的克隆容量较大，可以携带较大的外源基因。
然而，pYr载体的缺点是可能存在背景表达和在酵母菌群体中存在多拷贝插入，这可能会导致表达系统的不稳定性。
2. pYX表达载体：pYX是另一种基于天然酵母表达载体，它可以实现高效的酵母菌表面展示。
与pYr相比，pYX载体的优点在于其表达水平更高、表达系统更稳定，并且不易发生多拷贝插入。
此外，pYX载体的克隆容量较大，可以携带较大的外源基因。
然而，pYX载体的缺点是其表达水平很高，可能会导致细胞毒性和表达产物的不稳定性。
3. pPICZ表达载体：pPICZ是一种自行构建的表达载体，通常用于构建酵母菌表面展示系统。
它具有较高的表达水平和表达稳定性，并且能够在酵母细胞中实现可调控的外源基因表达。
基因工程-外源基因在酵母菌中的表达
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因
酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因酵母菌表面展示是一种常用的蛋白质工程技术，通过将外源基因转入酵母菌表面展示系统，实现目标蛋白质在酵母菌表面的展示和筛选。
下面将介绍酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因的具体步骤。
1. 提取外源基因：首先，需要从源细胞中提取所需的外源基因。
外源基因可以通过PCR扩增、酶切或合成等方法得到。
确保提取到的基因具有正确的序列，并进行验证。
2. 构建表达载体：将提取到的外源基因与适当的表达载体连接。
表达载体通常包括启动子、终止子、选择标记和酵母菌表面展示相关的信号序列。
确保外源基因与表达载体正确连接，并进行验证。
3. 转化酵母菌：选取适合的酵母菌株，并将构建好的表达载体转化到酵母菌中。
转化方法可以根据实验需求选择化学法、电转法或基因枪等。
转化成功后，利用适当的培养基对转化后的酵母菌进行筛选和生长。
4. 筛选积极克隆：将转化后的酵母菌接种到含有选择标记的培养基中，进行筛选。
通过筛选，可以获得表达载体成功转入外源基因的积极克隆。
此步骤通常需要一定时间，取决于所选择的培养基和酵母菌株的特性。
5. 鉴定表达：对筛选出的积极克隆进行表达检测。
可以利用Western blotting等方法，检测目标蛋白是否在酵母菌表面成功展示。
确保所筛选出的克隆具有预期的表达效果。
6. 进一步应用：对表达成功的酵母菌克隆进行进一步的应用。
可以利用这些酵母菌克隆进行蛋白质相互作用研究、酶活性检测、抗原表位筛选等。
根据实际需求进行相应的实验设计和操作步骤。
以上是酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因的基本流程。
在实验过程中，需要注意优化实验条件，保证实验的重复性和可靠性。
同时，根据实验需求调整各个步骤的细节，以获得最佳的实验结果。
基因工程中酵母菌表达系统的特点和作用
将转化物接种HIS4缺陷平板进行第一轮筛选。
用不同浓度的G418平板进行第二轮筛选。
挑选10－20个克隆进行小规模诱导培养，鉴定外源基因的表达量。
挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养以制备外源基因的表达蛋白质。
另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。
二、常用酵母表达系统（宿主－载体系统）
（1）酿酒酵母表达系统
酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30
kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
一、酵母表达系统的特点
酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
巴斯德毕赤酵母具有翻译后修饰功能，如信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化作用等其与糖基化位点其他哺乳动物细胞相同。
（3）裂殖酵母表达系统
裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有许多与高等真核细胞相似的特性，它所表达的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性。遗憾的是，目前对它的研究较少。
酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列（ARS），能够独立于酵母染色体外进行复制
，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。
将目的基因导入酵母菌的方法
将目的基因导入酵母菌的方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：将目的基因导入酵母菌是一种常见的实验技术，可以用于基因工程、生物学研究和生物技术应用等领域。
以下是关于将目的基因导入酵母菌的方法的详细介绍。
一、介绍酵母菌是一种常见的真菌，广泛应用于食品发酵、生物燃料生产和药物生产等领域。
将外源基因导入酵母菌可以改变其代谢特性、增强其生产能力，从而扩大其应用范围。
下面将介绍将目的基因导入酵母菌的方法。
二、选择适当的表达载体在将目的基因导入酵母菌之前，首先需要选择一个适当的表达载体。
常用的表达载体有质粒、病毒、质粒体等。
质粒是最常用的表达载体，因为它具有较强的载体稳定性和易于操作的特点。
还需要考虑选择适当的启动子、选择子和标记基因等。
三、构建目的基因载体构建目的基因载体是将目的基因插入到选择的载体中，以便将其导入酵母菌。
首先需要将目的基因进行PCR扩增，获得目的基因的DNA序列。
然后，将目的基因与载体进行连接，可以通过酶切和连接、PCR扩增等方法进行。
最终构建出目的基因载体。
四、转化酵母菌转化是将构建好的目的基因载体导入酵母菌的过程。
目前常用的转化方法有质粒转化、电穿孔法、化学转化、凝血作用等。
质粒转化是最为常用的方法。
质粒转化的步骤主要包括酵母菌细胞的预处理、质粒的导入和细胞的再生。
五、筛选阳性转化子在转化酵母菌后，需要进行阳性转化子的筛选。
阳性转化子是指成功导入了目的基因的酵母菌细胞。
常用的筛选方法有抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、基因荧光标记筛选等。
通过有效的筛选方法，可以获得目的基因成功导入的阳性转化子。
六、验证目的基因的表达最后一步是验证目的基因在酵母菌中的表达情况。
可以通过RT-PCR、Western blot等方法来检测目的基因的表达水平。
验证表达成功后，即可进行后续的实验和应用。
在将目的基因导入酵母菌的过程中，需要注意以下几个方面的问题：1. 酵母菌细胞的处理条件，包括培养基的配制、细胞密度的控制等。
酵母菌表面展示操作步骤之转形酵母菌
酵母菌表面展示操作步骤之转形酵母菌转形酵母菌是一种常用于表达外源蛋白的生物工具。
通过将外源基因导入酵母菌细胞，可以使酵母菌表面展示目标蛋白，从而实现其研究、应用和生产利用。
下面是转形酵母菌的操作步骤：步骤一：准备实验材料和试剂在进行酵母菌的表面展示前，需要准备一些常用的实验材料和试剂，包括：酵母菌菌种、培养基（如YPAD）、选择性培养基（含相应抗生素）、含转形试剂的培养基（如SOB培养基）、PCR产物或启动子-报告基因载体、聚乙烯醇（PEG）/锂醋酸转化体系。
步骤二：培养酵母菌菌种首先，从酵母菌菌种库中取出所需菌株，接种到含有适当营养物的固体培养基（如YPAD平板）中，培养过夜在30°C下。
然后，从过夜培养的单菌落中挑取菌落，接种到含有适当营养物的液体培养基中，进行前驱培养。
步骤三：制备DNA或载体根据需要表达的目标蛋白的编码基因序列，利用PCR方法扩增出相应的DNA 片段。
在反应中加入引物和模板DNA，通过酶切、连接、转化等步骤，将目标蛋白的编码基因插入酵母菌表达载体中。
步骤四：转化酵母菌细胞将制备好的DNA或载体与酵母菌细胞共转化，使外源基因导入酵母菌细胞。
将DNA或载体和酵母菌细胞按照适当的比例混合，然后在冰上静置20-30分钟，使DNA与酵母菌细胞发生结合。
接下来，在热激冷激转化条件下，使用PEG/锂醋酸转化体系或其他合适的方法进行转化。
步骤五：筛选转化子将转化后的混合物均匀涂布在含有选择性抗生素的固体培养基上，培养足够时间以让幸存的转化子形成菌落。
通过筛选，可以获得具有外源基因的转化子。
步骤六：诱导表达目标蛋白选取含有外源基因的转化子，将其转接到启动子-报告基因载体中。
将构建好的重组酵母菌细胞接种到诱导培养基中，促使目标蛋白的表达。
在适当的时间和条件下，培养酵母菌细胞，使其表达目标蛋白。
步骤七：表征和检测目标蛋白通过Western blot、荧光显微镜等方法，对表达的目标蛋白进行检测和表征。
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示方法
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示方法表面展示方法是一种常用的酵母菌表达外源蛋白的技术，它通过将目标蛋白与表面展示蛋白基因融合，使其能够在酵母菌细胞表面显示。
表面展示方法可以应用于酵母菌工程、酵母菌表达系统、抗原表位验证等领域。
下面将介绍一种常用的酵母菌表面展示方法操作步骤。
步骤一：选择表面展示蛋白基因首先需要选择一个适合的表面展示蛋白基因。
常用的表面展示蛋白基因有AGA2、Aga1、Flo1等。
这些基因可与目标蛋白基因进行融合，在酵母菌细胞表面显示目标蛋白。
步骤二：构建融合蛋白基因在这一步中，需要将目标蛋白基因与表面展示蛋白基因进行融合。
可以通过PCR技术将两个基因进行连接，并在连接处添加合适的链接序列。
连接后的基因可以通过限制性内切酶等方法插入到表达载体中。
步骤三：将融合基因插入酵母菌将构建好的融合基因插入酵母菌表达载体中。
一般来说，可以利用特定的限制性内切酶进行酵母菌基因组中的特定位点插入。
插入后，利用酵母转化技术将表达载体导入酵母菌细胞内。
步骤四：酵母菌培养与筛选将转化后的酵母菌进行培养，以使其表达目标蛋白。
在培养过程中，可以利用选择性培养基选择表达目标蛋白的酵母菌。
例如，添加适量的抗生素，只有带有表达载体的酵母菌能够存活下来。
步骤五：检测与分析对表达目标蛋白的酵母菌进行检测与分析。
可以利用免疫学方法，例如Western blotting或ELISA等，检测蛋白的表达水平。
同时，也可以利用流式细胞术等技术，分析目标蛋白在酵母菌表面的展示情况。
需要注意的是，每个实验室、项目的具体操作步骤可能会有所不同。
因此，在实施表面展示方法之前，请务必查阅相关文献，了解相关实验操作细节，以确保实验的准确性和可靠性。
酵母菌表面展示方法是一种重要的生物技术手段，可以用于多种实际应用中。
通过掌握和运用这一技术，能够实现对目标蛋白的高效表达与展示，为相关研究提供有力工具。
希望本文能对您了解酵母菌表面展示方法有所帮助。
一种重组酵母菌株及其构建方法和应用与流程
一种重组酵母菌株及其构建方法和应用与流程引言：重组酵母菌株是指通过基因重组技术将外源基因导入酵母菌中的一种菌株。
重组酵母菌株的构建方法可以分为直接转化法、原生质体法和自由质粒法等多种方式。
重组酵母菌株在生物医药、农业生物技术和食品工业等领域具有广泛的应用前景。
一、重组酵母菌株的构建方法1. 直接转化法：将外源基因和酵母菌细胞一起处理，使外源基因转化到酵母菌细胞内。
该方法适用于酵母菌对外源DNA接受性较高的情况，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
直接转化法的优点是操作简单、效率高，但对于某些酵母菌株效果不佳。
2. 原生质体法：将外源基因和酵母菌细胞分别处理，然后通过融合原生质体的方式将外源基因导入到酵母菌细胞内。
该方法适用于酵母菌对外源DNA接受性较低的情况，如担子酵母(Pichia pastoris)。
原生质体法的优点是适用范围广，可以用于多种酵母菌株的基因转化。
3. 自由质粒法：将外源基因和质粒分别处理，然后通过质粒转化的方式将外源基因导入到酵母菌细胞内。
该方法适用于酵母菌株对外源DNA接受性较低的情况，如甘露酵母(Candida utilis)。
自由质粒法的优点是无需使用化学试剂，操作相对简单。
二、重组酵母菌株的应用与流程1. 生物医药领域：重组酵母菌株被广泛应用于生物医药领域，可用于生产重组蛋白、抗体和疫苗等。
流程包括选择合适的酵母菌株、构建重组酵母菌株、表达目的基因、纯化目的蛋白等步骤。
2. 农业生物技术领域：重组酵母菌株可用于农业生物技术领域的基因转化和基因编辑。
例如，通过导入抗虫基因，可以使酵母菌株具有抗虫性，从而减少农药使用。
流程包括选择适合的酵母菌株、导入目的基因、鉴定转基因酵母菌株的稳定性和表达效果等。
3. 食品工业领域：重组酵母菌株可用于食品工业领域的发酵生产。
例如，通过导入酵母菌株具有产酶能力的基因，可以使酵母菌株在发酵过程中产生特定的酶，如纤维素酶、蛋白酶等，从而提高发酵产品的品质和产量。
外源基因表达的基本流程
外源基因表达的基本流程包括以下几个关键步骤：克隆：1.1.选择合适的限制性内切酶将外源基因从其原始DNA中切割出来。
2.将切割后的外源基因插入到表达载体（如质粒、病毒载体等）的多克隆位点，确保正确的阅读框和若为分泌型蛋白还需考虑信号肽序列的一致性。
重组载体构建：1.通过连接酶的作用将外源基因与线性化的载体连接起来形成重组DNA分子。
2.验证重组体是否成功构建，通常采用PCR、酶切分析或测序技术。
2.转化：1.将重组载体导入宿主细胞，常见宿主有大肠杆菌、酵母菌或其他哺乳动物细胞系。
2.转化方法可以是电穿孔法、热激法、PEG介导法或者原生质体融合法等。
3.筛选与鉴定：1.在含有合适选择标记（如抗生素抗性基因）的培养基上筛选转化成功的细胞。
2.进一步通过PCR验证、Southern blotting 或 Westernblotting等方法确认外源基因是否已整合入宿主染色体并正确表达。
4.诱导表达（对于可调控表达系统）：1.如果使用的是诱导型表达系统，会在适当时间加入诱导剂（如IPTG对 lac 操纵子的诱导），促使外源基因开始转录和翻译。
5.表达产物检测与纯化：1.表达出的蛋白质可以通过SDS-PAGE、Western blotting等方法进行定性和定量分析。
2.对于需要进一步应用的重组蛋白，还需要通过亲和层析、离子交换层析等多种纯化策略得到高纯度的目的蛋白。
功能鉴定：1.最后，对外源基因编码的蛋白质进行生物学功能的测定，以证明其活性和用途，比如在药物研发、疫苗生产或遗传疾病治疗中的应用。
酵母菌中表达外源蛋白的优势
2019/2/2
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Two-step gene replacement. This procedure allows the experimenter to introduce any type of mutation anywhere in the yeast genome, without leaving behind vector sequences or a selectable marker. The desired mutation with flanking sequences is cloned into a conventional plasmid that also contains a marker that can be selected both for and against. URA3 and ura4+ are usually employed for this purpose in S. cerevisiae and S. pombe, respectively. Then the plasmid is digested with a restriction enzyme that cuts once within the yeast sequences flanking the mutation and is introduced into yeast by transformation. The DNA break stimulates recombination within the flanking sequences, leading to integration of all the vector sequences and the mutated yeast sequences into the chromosome of the recipient yeast cell. Note that there is a duplication of the target sequences, with one copy containing the mutation and the other copy retaining the wild type sequence.
基因工程与酵母菌表面展示载体构建
基因工程与酵母菌表面展示载体构建基因工程是一种利用生物技术手段对生物体的基因进行修改和重新组合的过程。
而酵母菌表面展示载体则是一种将外源蛋白质表达在酵母菌表面的工具，用于研究和应用于生物医药领域。
本文将介绍基因工程与酵母菌表面展示载体构建的相关知识和步骤。
首先，进行基因构建前的准备工作。
确定目标蛋白质的序列，为此可以利用已有的文献或数据库进行搜索和筛选。
然后选择合适的酵母菌表面展示载体进行基因的导入和表达。
酵母菌表面展示载体一般包括信号序列、载体复制源、选择标记和目标蛋白质的表达区。
其次，进行基因克隆。
将目标蛋白质的基因序列与酵母菌表面展示载体连接在一起。
这可以通过PCR扩增目标基因、线性化载体，然后利用连接酶将目标基因和载体连接。
也可以利用限制酶将目标基因和载体进行酶切，然后进行连接。
然后，将构建好的基因载体导入酵母菌细胞中。
酵母菌细胞可以利用电转化、化学转化或冷冻转化等方法进行导入。
其中，电转化是最常用的方法，它利用高压脉冲将DNA导入细胞内。
接着，进行酵母菌细胞的培养和表达。
将导入基因载体的酵母菌细胞培养在适当的培养基中，利用荧光检测、Western blot或质谱等方法确认目标蛋白质在细胞内的表达情况。
如果目标蛋白质表达不稳定或表达量较低，可以尝试优化培养条件、选择合适的诱导剂或筛选高表达株系，以提高目标蛋白质的表达水平。
最后，进行酵母菌表面展示验证。
利用荧光显微镜、流式细胞术或ELISA等技术，检测目标蛋白质是否成功表达在酵母菌表面，并研究其在表面展示状态下的稳定性与活性。
还可以利用此酵母菌表面展示系统进行基因工程和酵母菌载体的进一步应用研究，比如疫苗研发、抗体筛选、高通量蛋白质互作研究等。
总结起来，基因工程与酵母菌表面展示载体构建是一项复杂而又有趣的科研工作。
通过合理的基因构建、基因导入和表达调控等步骤，可以实现目标蛋白质的可视化表达和展示，为生物医药领域的研究和应用提供了有力的工具和手段。
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酵母菌表达系统的选择
乳酸克鲁维酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被 广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳 定性载体，即便在无选择压力的条件下， 也能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的 重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。
酵母菌表达系统的选择
巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的 甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途 径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇 AOX11 氧化酶基因AOX11所属强启动子、表达的可诱导 性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体， 所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色 体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在 很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵 母系统中获得成功表达。
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI 4缺陷型： 缺陷型： 缺陷型 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突 变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株 要低得多，因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的 受体 UBA 1缺陷型： 缺陷型： 缺陷型 UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的 蛋白降解 Ubc4 - ubc5 双突变型： 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建 CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀 分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的 新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷 贝数只有1 - 5个 含有TELL的YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
利用重组酵母生产乙肝疫苗
乙型肝炎病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
乙型肝炎病毒的结构与性质
乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具 有感染力的病毒； 乙型肝炎病毒的结构颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要结构蛋 白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽， HBsAg S 它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋 白成份包括核心抗原（ HBcAg ）和病毒DNA聚 合酶、微量病毒蛋白； 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成 并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原 性是未装配的各种包装蛋白组份的1000倍。包装 蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。
外源基因在酵母菌中的表达
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特 征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于 子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担 子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌）， 共由56个属和500多个种组成。 如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核 生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核 生物表达系统。
酵母菌表达系统的选择
多型汉逊酵母表达系统 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制 序列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， 但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞 有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是， HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体 DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋 白在该系统中获得成功表达。 ，因此重组多型汉 逊酵母的构建也是采取整合的策略。
F利用重组酵母生产乙肝疫苗 利用重组酵母生产乙肝疫苗
由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢 性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约 有220000万病人死亡，并有33亿人成为 HBV携带者，其中相当一部分人可能转化 为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病 毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯 度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重 大的社会效益，而利用重组酵母大规模生 产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保 证。
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧 链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质 的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外 侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有蛋白质的 糖基化系统，但野生型酿 酒酵母对异源蛋白的糖基 化反应很难控制，呈超糖 基化倾向，因此超糖基化 缺陷株非常重要。
酵母菌的载体系统
酵母菌克隆表达质粒的构建 酵母菌中的野生型质粒
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的2环状质粒 几乎所有的酿酒酵母中都含有2双 链环状质粒，拷贝数达50至100 个。 IRs 反向重复序列，600 bp，重组 FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以 及克鲁维酵母属中的pKD1等均与 2质粒类似。
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的 原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化 1-2% 细胞可达原生质体总数的1-2%。 但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质 再生率的严重制约 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细 胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的 原生质体占转化子总数的25-33%
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA 特定序列和标记基因， 构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒 通常插在染色体DNA特定序列中，这样目 的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色 体DNA区域.
酵母菌的转化系统
转化质粒在酵母细胞中的命运 酵母菌的转化程序 用于转化子筛选的标记基因
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因 酵母菌共有四个泛素编码基因 UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期 表达稳定期关闭 UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期 表达稳定期关闭 UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期 表达稳定期关闭 UBI 4 编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达 酵母菌共有七个泛素连接酶基因： UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、 UBC 7
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+ 等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸 收质粒DNA，而且具有下列特性：
吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相 差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条 件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免 使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大 的负作用。 电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗 传特征及培养条件适用范围广，而且转化 率可高达105 / gDNA。
用于转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有 营养缺陷型互补基因和显性基因两大类 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷 酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、 LYS、URA、ADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型 的受体非常困难
用于转化子筛选的标记基因
显性标记基因
酵母菌的表达系统
外源基因在酵母菌中表达的限制因素 酵母菌启动子的可控性 酵母菌表达系统的选择
酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子 酿酒酵母的半乳 糖利用酶系由 GAL1 GAL7和GAL10 基因编码
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
外源基因稳态 外源基因稳态mRNA的浓度 的浓度 外源基因 外源基因mRNA的翻译活性 的翻译活性 酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油 醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶 PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的 氨基酸是由25个密码子编码的
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活 性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷 PKG ADH 酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属 的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能 力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等） 与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺 陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补
转化质粒在酵母细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是 双链的10-30倍； 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转 化为双链并复制； 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同 源整合入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组 极为有利； 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受 体细胞的染色体DNA的同源序列，会发生高频同 源整合，整合子占转化子总数的50-80%。
பைடு நூலகம்
酵母菌的宿主系统
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 酵母属如酿酒酵母（ ） 克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces 克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（ lactis） ） 毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（ ） 裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharoyces 裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（ pombe） ） 汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 汉逊酵母属如多态汉逊酵母（ ） 其中酿酒酵母 酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯 酒酵母 巴斯 德毕赤酵母表达外源基因最理想。 德毕赤酵母