成纤维细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光
【原理】
免疫细胞化学，是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

免疫细胞化学有多种染色方式，免疫荧光法即为其中一种染色方式，其结合激光共聚焦扫描显微镜拍照技术，可提高检测分辨率，更精确地检测抗原的细胞定位和分布。

【材料】
1、仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、正置荧光显微镜、高压灭菌锅；
2、试剂：DMEM培养基、胎牛血清、乙醇、PBS、0.25%胰酶、4%多聚甲醛、SMN一抗、
FITC荧光二抗、抗荧光衰减封片剂、TritonX-100；
3、细胞株：成纤维细胞系。

【步骤】
一、准备工作
1、切片处理：将盖玻片置于浓酸浸泡过夜，自来水冲泡20遍，蒸馏水清洗5遍，高压灭
菌，烘干备用；
2、细胞悬液制备：胰酶消化的成纤维细胞，收集细胞沉淀，培养基重悬，制成单细胞悬液，
计数后稀释至最佳浓度备用。

二、细胞爬片
1、6孔板中央滴加100ul培养基，每孔放入一张盖玻片，恰好覆盖孔内培养基；
2、每孔缓慢逐滴加入2ml稀释后的细胞悬液，轻柔混匀；
3、将6孔板置于CO2孵箱，培养过夜。

三、免疫荧光
1、取出6孔板，弃掉孔内培养基，PBS轻柔清洗3次，每次3min；
2、每孔加入1ml预冷的4%多聚甲醛，4℃固定20min；
3、PBS轻柔清洗3次，每次3min；
4、每孔加入1ml含0.2%TritonX-100的PBS，冰上静置10min；
5、PBS轻柔清洗3次，每次3min；
6、每孔加入1ml含1%BSA的PBS，室温封闭1h；
7、将一抗以1:100的比例稀释后，取出50ul滴加在封口膜上，从培养孔中取出盖玻片，用吸水纸吸去背面及细胞面边缘处的液体后，轻轻放在封口膜上，细胞面与抗体均匀接触，4℃孵育过夜；
8、取下盖玻片，置于6孔板相应孔中，PBS轻柔清洗3次，每次3min；
9、滴加荧光素二抗，37℃孵育30min；
10、PBS轻柔清洗3次，每次3min；
11、每孔加入500ul DAPI染色液，室温染色5min；
12、PBS轻柔清洗3次，每次3min；
13、取一张洁净载玻片，中心位置滴加50ul抗荧光淬灭封片剂，从6孔板中取出盖玻片，控干液体，贴有细胞的一面朝下，放置在封片液上，尽量避免气泡；
14、显微镜下观察、拍照。