第7章 亲和层析

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第四节 应用实例
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第一节 基本原理
M L S
蛋白质2与配体无 生物学特异性
1
2
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一、亲和层析的概念


亲和力
根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分 子特异识别和可逆结合的特征,将生物分子间的这种结 合能力称为亲和力。
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2.纯化糖类分子

配体为外源凝集素的 Sepharose 6B的亲和层析介质,
特异地结合碳水化合物的糖类
残基或糖化细胞膜组分、细胞、
亚细胞结构及糖蛋白等。
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凝集素和糖蛋白的亲和层析分离

凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。
金属螯合层析
基于蛋白质的组氨酸咪唑基和半胱氨酸巯基能 与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物而进行分离 的。
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7.含有辅酶的酶类的亲和层析

四、残留活化基团的封闭

封闭多余的活化基团,避免非
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特异性吸附。
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内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
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第四节
应用
A280 A B
A.不保留峰 B.脱附峰 纵坐标示吸收值 横坐标示洗脱体积
欲分离物质与亲和吸附剂结合,当结合力较强 时,配体与有效成分紧密结合,随着样品的加入, 亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱,形成致密 的复合物带,使吸附容量增至最大,达到饱和。 影响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有 关。
复合物带
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样品中有效成分 在亲和吸附剂上的 吸附量,除了与它
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A
B
C = D
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5.受体蛋白的纯化

由于受体蛋白在激素与其 互补的膜结合中的重要作 用,同时其含量极低,使 研究受阻。利用亲和层析 法分离受体蛋白成为可能。 例:胰岛素受体蛋白的纯 化:将胰岛素偶联到溴化 氰活化的琼脂糖凝胶,结 合受体蛋白,特异性洗脱, 释放出目标蛋白质。
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第二节 操作
一、理想基质的性质
二、配基(配体)的选择
优良的配体必须具备两个条件: 配体与生物大分子具有合适的亲和力; 配体具有与载体牢固地结合,又不影响与生 物大分子之间的亲和力。

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专一性结合的生物体系
常用配体
酶蛋白 抗 体
Ve

亲和层析的基础是对蛋白质进行选择性的吸附- 脱附,一般的结果是层析图谱上出现二个层析峰, 不保留峰与脱附峰,脱附动力学一般较慢,脱附 的层析峰宽而拖尾。
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亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物; 2.分离糖蛋白、各种凝集素;
3.含巯基蛋白质的分离;
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亲和层析法
利用生物大 分子和固定相表 面存在某种特异
性吸附而进行选
择性分离的一种 生物大分子分离 的层析方法。
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亲和层析法的实质

是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有 一般反应性能的间隔臂,随后再连接配体(酶、抗原、 激素等)组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特 性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层 析柱,保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
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AAAAAAAAAAAAAAAAA
3.分离核酸
UUUUUUUUUUUUUUUUU
带PolyU (T) 的亲和吸附剂 分离含PolyA尾巴的mRNA
UUUUUUUUUUUUUUU AAAAAAAAAAAAAAA UUUUUUUUUUUUUUU UUUUUUUUUUUUUUU
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■ 典型的亲和层析操作:
Protein
Activity
pH 2.05
*
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Elution volume
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五、亲和层析的特点

柱层析柱小 Vt=1~1.5ml。上样量大,达 1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。
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内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
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第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量,受以下因素的影响: 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小 基质的多孔性 操作条件等
它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些
多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白,可以有效 地分离纯化不同型的凝集素,也可应用固定化的凝集
素分离纯化各种糖蛋白。
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不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构, 它们和不同的凝集素呈现出不同的结合能力。 常用的凝集素 : Con A 、LCA 对甘露糖专一 WGA 对N-乙酰氨基葡萄糖专一
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6.重组蛋白


用基因工程的方法引入特 殊结合位点(如金属结合位 点),将其加在重组目的蛋白 的氨基端或羧基端 。 紧邻结合位点的位臵加入 蛋白酶切割位点,以便在用 亲和层析纯化之后,将多余的 蛋白质片段去掉 。
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的条件可增 加配体的偶
联数量。
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三、减少结合键增加配体与蛋白质的互补效 应

以蛋白质与多肽为配体时,以最少的共价键连接至 载体,利于保护蛋白质的高级结构及生物活性;
控制偶联反应的pH,减少蛋白质分子与基质连接的 键;位点的减少,可以结合更多的蛋白质,提高结 合容量。
AAAAAAAAAAAA
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AAAAAAAAAAAA 海南大学农学院wss44
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4.以亲和层析法纯化 Trypsin:
Disc-PAGE CHOM SDS-PAGE
Chitin
Trypsin
A
B
C&D
以凝胶电泳鉴定亲和层析 操作过程各步骤的样本→
分离对象
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等 抗原、病毒、细胞
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白 互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白 细胞表面特异性蛋白、外源凝集素
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外源凝集素 核 酸
激素及维生素 细
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蛋白质亲和层析中的合适配体
配体
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三、亲和层析具备的三要素


介质(基质)—具有活化基团
间隔臂— 连接介质与配体的分子

配体— 具有识别能力
反配体(分离物)— 与配体进行可逆结合
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■ 四、亲和层析法的四要点
配体 Ligand (L) 偶合反应 (3) Coupling Reaction
们之间的亲和力有
密切关系外,还与 样品的pH值和离子 强度有关系。
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五、层析步骤

样品制备
选择配体
结合步骤
凝胶与配体偶联
装柱操作

流速控制
柱子平衡
洗脱方法
淋洗

洗脱目标样品
柱子再生
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洗脱方法
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4.用寡聚核苷酸分离核酸;
5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
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1.抗原、抗 体的纯化
亲和吸附剂:基质-间隔臂-抗体(抗原)组 成,用于鉴定、分离、纯化样品中的抗原 (抗体)
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Protein A对IgG类物质有较大的束缚力,加之免疫球蛋白被 束缚之后仍保留了IgG束缚抗原的特性。所以利用结合IgG的 Protein A-Sepharose CL-4B吸附剂还可分离特异性的抗原。
第七章
亲和层析
Affinity chromatography
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技术背景
各种大分子物质之间理化特性的差异性。 但如果这种差异性较小,纯化较麻烦,最终收得 率很低。

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内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
常见的间隔臂是6~8个碳原子的碳氢链,基质到配 体的长度为0.5~1nm;或用长达17个碳原子。
间隔臂:不同长度的间隔臂 (B=1nm),(C=2.1nm)对 靶酶的亲和力的差异。
对氨基苯-β-硫代吡喃半乳糖苷
氨乙基乙酰胺
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二、增加配体取代的程度

基质的活性基团增多,配体结合量增加,操作容量 亦大;由于位阻效应而影响配体的偶联量,故控制 偶联反应


操作简单,时间快速。
柱子填充载体昂贵,配体的特异性,有时找不 到适宜的配体,不适合所有生物大分子样品。
PriboFast ®黄曲霉毒 素B1免疫 层析亲和柱
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内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作
第三节 提高吸附剂的操作容量
第四节 应用实例
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X
B
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特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层 析法:
方法 特异性配体亲和 层析法 配体 性能
复杂的生命大分子 具有较强的吸附选 物质(如抗体、受 择性和较大的结合 体和酶的类似底物 力 等)
通用性配体亲和 层析法
简单的小分子物质 成本低廉,具有较 (如金属、染料、 高的吸附容量,通 以及氨基酸等) 过改善吸附和脱附 条件可提高层析的 分辨率
抗原
待纯化的蛋白质
特定单克隆抗体或多 克隆抗体 特定抗原 免疫球蛋白 蛋白酶 磷酸酶 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素
配体
肝素
待纯化的蛋白质
凝聚因子、脂酶、结 缔组织蛋白酶、DNA聚 合酶 胆固醇受体、胆固醇 结合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白 蛋白 核苷酸结合蛋白、需 核苷酸的酶 糖蛋白 糖蛋白
单克隆抗体 蛋白质A/蛋白 质G 蛋白酶抑制剂 磷酸 三嗪染料
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一、引入间隔手臂
小分子配体直接连接于琼脂糖上会产生无效吸附, 其原因是由于载体的空间位阻关系,使大分子化合 物(亲和物)不 能直接接触到配 体。因此,通过在 载体与配体之间引 入适当长度的“手 臂”减少载体的空 间位阻,增加配 体的活动度。
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S
(1)
Solid Matrix
溶解 Elution (4)
S
(2) S Specific Binding Substance (S)
S
S
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杂 质
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五、亲和层析的特点

条件温和:不影响样品的生物活性,适合生物大 分子的操作。 纯化效率高:一步法分离和纯化混合物中的样品, 提纯达几千倍,得到高纯度样品。 选择性强:依据生物学特异性,而非物理化学性 质分离原理。故特异的层析图为2个峰,第1个为 杂峰,第2峰为纯品。
胆固醇 脂肪酸 核苷酸 苯基硼酸 盐 凝集素
抗生物素蛋白
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含生物素的酶
糖ห้องสมุดไป่ตู้
凝集素、糖苷酶
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三、亲和吸附剂的制备

载体的活化(CNBr)

配体的偶联

结合能力的测定 用溴化氰活化载体
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四、特异性吸附
A.特异性洗脱:
凡是能与配体竞争酶的游离配体,都十分强烈 地影响着结合酶的洗脱过程。游离配体浓度若与 配体浓度相同,则可直接从基质上洗脱小结合的 酶。同时应根据酶与配体亲和力的大小确定洗脱 液的浓度。 B.非特异性洗脱:
通过改变洗脱液的条件(pH、离子强度、温度℃ 和介电常数),即能改变蛋白质的构象,降低蛋 白质与配体的亲和力、不损害蛋白质与吸附剂的 稳定性。
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■ 二、亲和层析法的作用机理
X
A (1) B A (2) (3) A
Washing
Elution
Sample
B 亲和基团 配体
固相载体
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