线性探针技术操作
结核性脑膜炎脑脊液分子检测技术概述
•专题笔谈•结核与肺部疾病杂志2021年3月第2卷第1期J Tuberc Limg Dis，March 2021，Vol. 2, No. 1结核性脑膜炎脑脊液分子检测技术概述韩利军赵雪瑶【摘要】结核性脑膜炎（tuberculous menmghiS，TBM)是常见的中枢神经系统结核病，早期诊断和及时治疗是 改善T B M患者预后的关键。
由于传统的结核分枝杆菌检测方法阳性率低、耗时长，临床缺乏有效的快速检测手 段，导致T B M的早期确诊非常困难。
作者针对T B M脑脊液分子检测技术的现状、最新研究进展，以及所面临的问 题进行评价和讨论，为指导结核病临床工作提供参考。
【关键词】结核，脑膜；脑脊髓液；分子诊断技术Molecular detection technologies for diagnosing tuberculous meningitis using cerebrospinal fluid HAN Li-jun , ZHAO Xue-yao. Tuberculosis Meningitis Diagnosis and Treatment Center^ Changchun Infection Hospital, Changchun 130062, ChinaCorresponding author：HAN Li-jun , Email：*****************【Abstract】Tuberculous meningitis (TBM) is a common tuberculosis disease affecting central nervous system.Early diagnosis and timely treatment are key to improve the prognosis of TBM patients. However, traditional detection methods of MTB are usually with poor sensitivity and time-consuming, we lack effective rapid clinic detection methods, thus it is very difficult to make early diagnosis of TBM. In the review, the current situation, latest progress and existing problems of TBM molecular detecting technologies for testing cerebrospinal fluid samples were displayed and discussed, to offer references for clinical practice.【Key words】Tuberculosis，meningeal; Cerebrospinal fluid；Molecular diagnostic techniques结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM)是最常见的中枢神经系统结核病，由于无特异的临 床表现及较低的实验室诊断敏感度，早期诊断TBM 非常困难；而诊断不及时会延误抗结核治疗的时机，导致高病死率和高致残率[1]。
MTBDRplus技术快速检测结核分枝杆菌耐多药的临床应用评价
MTBDRplus技术快速检测结核分枝杆菌耐多药的临床应用评价潘洁茹;叶海梅;吴祖达;张宝华;郑厚建【摘要】目的评价线性探针杂交技术(简称MTBDRplus技术)对福州地区耐药结核杆菌的检测效果,并了解该地区耐药结核分枝杆菌的耐药基因特征.方法选取246株临床结核分枝杆菌分离株,以传统罗氏药敏试验为金标准,评价MTB-DRplus技术在临床上应用的检测效果,分析耐药基因突变分布频率.结果与传统罗氏药敏试验相比较,MTBDRplus检测利福平(RIF)和异烟肼(INH)耐药性灵敏度分别为91.7％(11/12)和83.3％(15/18),MTBDRplus检测RIF和INH耐药性特异度分别为99.6％(238/234)和95.2％(217/228).12例rpoB基因存在突变的结核分枝杆菌中,58.3％rpoB基因S531L突变;26例katG和inhA基因存在突变的结核分枝杆菌中,57.7％(15/26)katG基因315突变;存在C15T位点突变的菌株仅9.1％(1/11)为INH耐药菌株.结论 MTBDRplus技术是一个敏感、特异的快速诊断耐多药结核病的有效方法,该技术在福州地区具有较好的应用前景.福州市耐药结核分枝杆菌以rpoBS531L和katG S315T突变型为主.建议谨慎判断结核分枝杆菌inhA基因C15T位点突变引起的INH耐药.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2019(035)006【总页数】5页(P509-513)【关键词】结核分枝杆菌;耐多药;线性探针【作者】潘洁茹;叶海梅;吴祖达;张宝华;郑厚建【作者单位】福州市疾病预防控制中心,福州 350004;福州市疾病预防控制中心,福州 350004;福州市疾病预防控制中心,福州 350004;联勤保障部队第九○○医院二部检验科,福州350003;连江县疾病预防控制中心,连江 350500【正文语种】中文【中图分类】R378耐药结核病的发生和流行成为结核病控制的重要障碍和急待解决的世界性严重公共卫生问题。
结核病实验室诊断技术介绍
1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
线性探针技术原理
mabA (orf1) inhA furA katG
ahpC
mutation
异烟肼耐药机制
INH
KatG
InhA NADH-dependent enoyl-ACP activity
mutation
Inactivation Inactivation INA/NAD analogue
Mycolic acid biosynthesis
准确性
一期评估结果
敏感性（%）特异性（%） PPV（%）
RFP
INH MDR
88 78 75
97 97 98
79 84 81
21
欢迎大家到国家结核病参比实验室 参观、交流！
Email: tbhain@
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基于多重PCR扩增,扩增产物通过反向杂交 技术与预先固化在试纸条上的特异性探针 杂交,通过检测rpoB基因突变确定对利福平 的耐药性；通过检测katG基因和inhA基因的 启动子区确定对异烟肼的耐药性。 标本：痰标本或菌株。 检测时间：1-2天报告结果。
10
PCR扩增
Gene
Pathogen Amplification Specific sequence
3
rpoB 基因突变
Musser J. M. (1995) Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clin Microbiol Rev, 8, 496-514. 4
INH
Permiability alteration?
7
ETH
CS
Inhibit MA synthesis
线性探针技术检测肺结核患者耐药情况临床评价
特异度分别为 ９０．８６％和 ８７．２４％。结论 ＨＡＩＮ技术能用于快速、准确地诊断利福平和异烟肼的耐药性，可作为辅助检测手段用于临床 结核病尤其是耐药结核病的诊治。
关键词：线性探针；利福平；异烟肼；耐药性检测；实验诊断
中图分类号：Ｒ４４６；Ｒ５２１
文献标识码：Ａ
文章编号：１００６－４９３１牗２０１９牘０２－００２３－０４
侯 婧，韩 ，张 艳，孟 婧
（安徽省胸科医院，安徽 合肥 ２３００２２）
摘要：目的 评价线性探针（ＨＡＩＮ）技术用于临床抗结核治疗的价值。方法 收集 ２５１例痰抗酸杆菌涂片阳性肺结核患者的痰标本， 以 罗 氏培 养 及药 敏 试 验为 “金 标准 ”，采用 ＨＡＩＮ技 术检 测 异烟 肼 及 利福 平 的耐 药 情况 。结 果 ＨＡＩＮ技术 对 男 性 涂阳 患 者 利 福平 （χ２ ＝０．６３４，Ｐ＝０．４２６）和 异 烟 肼 （χ２ ＝０．９５１，Ｐ＝０．３２９）的 耐 药 检 测 ，对 女 性 涂 阳 患 者 利 福 平 （χ２ ＝０．１７４，Ｐ＝０．６７６）和 异 烟 肼 （χ２＝２．７９１，Ｐ＝０．０９５）的耐药检测，以及全部涂阳患者利福平（χ２＝０．８０６，Ｐ＝０．３６９）和异烟肼（χ２＝０．０１２，Ｐ＝０．９１４）的耐药性检测 效果与“金标准”比较，差异均无统计学意义 牗Ｐ＞０．０５牘。ＨＡＩＮ技术对利福平和异烟肼耐药检测的灵敏度分别为 ８７．６９％和 ５７．７３％，
综上所述，三七总皂苷对心肌缺血模型大鼠的血清 生化学和血液流变学指标有一定改善作用，其机制可能 与抗氧化和改善血液质量有关。
犤８犦姬艳苏，冯利民 ．三七总皂苷对心肌缺血大鼠血清 ＩＬ－６和 ＡｎｇⅡ的影响 犤Ｊ犦．江苏中医药，２０１４，４６（４）：７２－７３．
２０１３，４８（１１）：８９９－９０３． 犤４犦秦旭航，孙敬蒙，郑 菲，等 ．三七总皂苷类脂质体抗急性心
线性探针技术快速检测肺结核耐药性临床研究
线性探针技术快速检测肺结核耐药性临床研究王华;包训迪;刘双;李晔【摘要】Objective Evaluation of the reliability and timeliness of the rapid detection of drug resistance of smear positive pulmonary tuberculosis by linear probe technique. Methods 120 cases of smear positive tuberculosis patients with sputum specimens were randomly selected in our hospital. Both linear probe technique and traditional culture drug sensitivity test were used to detect isoniazid and rifampicin resistance of sputum specimens. The tradi-tional method was used as golden standard to evaluate the sensitivity, specificity and timeliness of linear probe tech-nique in the diagnosis of drug resistant tuberculosis. Results Detected by linear probe, sensitivity and specificity of the isoniazid were 100 % and 98. 98%, the rifampicin were 96. 15% and 98. 94% , The detection rate of drug re-sistance is 18. 33%. The test report was get within 24 hours. Conclusions Drug resistance of isoniazid and rifampi-cin can rapidly detected by linear probe technique. It' s advantageous to quick screening and clinical immediate diag-nosis of drug resistant tuberculosis, especially the multi drug resistant tuberculosis.%目的评价线性探针技术快速检测涂阳肺结核耐药性的可靠性和及时性.方法随机抽取我院收治的120例涂阳肺结核患者痰标本,同时采用线性探针技术和传统培养药敏试验两种方法检测异烟肼和利福平耐药性,以传统培养药敏试验结果为金标准,分析线性探针技术诊断耐药结核病的灵敏性、特异性和及时性.结果线性探针技术检测异烟肼的灵敏性和特异性分别为100%、98.98%;检测利福平分别为96.15%、98.94%;对耐多药的检出率18.33%.24小时内可得到报告.结论线性探针技术能快速检测异烟肼、利福平的耐药性,有利于耐药肺结核特别是耐多药肺结核的快速筛查和临床及时诊治.【期刊名称】《临床肺科杂志》【年(卷),期】2016(021)005【总页数】3页(P856-857,861)【关键词】线性探针技术;结核分枝杆菌;耐药结核病;异烟肼;利福平【作者】王华;包训迪;刘双;李晔【作者单位】230061 安徽合肥,安徽省胸科医院结核八科;230061 安徽合肥,安徽省胸科医院结核八科;230061 安徽合肥,安徽省胸科医院结核八科;230061 安徽合肥,安徽省胸科医院结核八科【正文语种】中文中国是全球22个结核病高负担国家之一，也是全球27个耐药结核病高负担国家之一。
分子线性探针技术在结核分枝杆菌及耐药性快速检测中的应用探究
分子线性探针技术在结核分枝杆菌及耐药性快速检测中的应用探究发表时间：2016-09-20T15:02:50.680Z 来源：《医药界》2016年6月第6期作者：汤洪萍1，龙波2，杨筠2，何博文1，马建明1，陈娟1 [导读] 线性探针方法适用于临床肺结核患者异烟肼、利福平耐药快速检测。
（1.成都市龙泉驿区疾病预防控制中心，四川成都 610100；2.四川省疾病预防控制中心，四川成都610041）【中图分类号】Ｒ378.9 【文献标识码】 A 【文章编号】 1550-1868（2016）6【摘要】目的：探究分子线性探针技术应用于临床肺结核/耐药肺结核患者快速诊断可行性及可靠性。
方法：收集成都市龙泉驿区临床疑似肺结核病患者痰标本，对比分析传统比例法药敏试验和线性探针技术对异烟肼(INH)、利福平(RFP)耐药检测效能。
结果：传统比例法药敏实验检测出103份结核分枝杆菌核酸检测阳性标本异烟肼(INH) 耐药14例(13.59%)，利福平(RFP) 耐药5例(4.85%)、耐多药肺结核（MDR-TB）41例(39.81%)；线性探针技术检测出103份结核分枝杆菌核酸检测阳性标本异烟肼(INH)耐药13 例(12.62%)，利福平(RFP)耐药6 例(5.83%)、耐多药肺结核（MDR-TB）41例(39.81%)，两种检测方法差异无统计学意义。
结论：线性探针方法适用于临床肺结核患者异烟肼、利福平耐药快速检测。
【关键词】结核分枝杆菌; 耐多药结核病; 线性探针法; 药敏试验Molecular line probe technique used in Mycobacterium tuberculosisand its drug resistance Application study of rapid detectionAbstract：Objective To explore the feasibility and reliability of the molecular line probe technique used in rapid diagnosis ofclinical drug-resistant tuberculosis, or TB patients. Methods Sputum samples of suspected cases which were lodged in Longquanyi District were collected. The detection performance of conventional susceptibility testing proportion method and linear probe technology to isoniazid (INH), rifampicin(RFP) drug were analyzed comparatively. Results The proportion of conventional susceptibility testing method detected 103 parts by Mycobacterium tuberculosis nucleic acid testing positive samples INH resistance 14 cases (13.59%), RFP resistant 5 cases (4.85%), 41 cases of multidrug-resistant tuberculosis (39.81%); linear probe technology detected 103 parts by Mycobacterium tuberculosis nucleic acid testing positive samples INH resistance 13 cases (12.62%), RFP resistant 6 cases (5.83%),41 cases of multidrug-resistant tuberculosis (39.81%) both detection difference was not statistically significant. Conclusion It is applicable for rapid detection by molecular line probe technique in clinical tuberculosis patients with isoniazid-resistance and rifampicin-resistance.Key words:Mycobacterium tuberculosis; multidrug-resistant tuberculosis; linear probe; susceptibility test 结核病是由结核杆菌侵入人体后引起的一种具有强烈传染性的慢性消耗性疾病，不受年龄、性别、种族、地区的影响，人体多器官、系统均可患结核病，其中以肺结核最为常见。
线性微透析探针用户指南(上)
LM线性探针用户指南02/06转A-1340介绍微透析采样的应用起源于神经科对于大脑内部组织的研究。
微透析采样技术在药代动力学中的应用已被证明有许多优势：比如频率更高的采样数据点，更加纯净的样品，以及样品在每次研究中在被试动物体内更少的损耗。
BAS线性组织探针适用于对于外周组织的体内采样：例如真皮层、皮下组织、肌肉、肝脏等器官。
微透析探针由一截短的中空透析纤维分别与窄孔的入口和出口管连接而成。
与组织周围体液中成分相近的灌注液以恒定的流速泵入并通过探针。
小分子量分析物可以在探针内外自由扩散，而大分子如蛋白质或蛋白质化合物则被透析膜排除在探针外。
进入透析管内的分子被连续流动的灌流液不断带出。
透析所得液体将被收集起来以供分析。
设计标准探针透析膜的有效长度有10毫米或5毫米两种。
设计长的入口和出口管能够在用于清醒的动物时，使得探针在皮下组织更容易外化。
纤维骨架有助于增加探针植入时的强度。
塞子在纤维骨架延伸的一端密封探针。
这个塞子可防止在手术中有体液进入探针。
它需要在探针连接到注射推进器并被灌注液体前切断。
半透膜纤维骨架临时塞子（保护探头在植入）探针制备半透膜的腔体内涂有一层甘油保护膜。
在去除之前，甘油可能会干扰实验结果或影响恢复。
因此在体内研究中，探针植入时一般不需要冲洗。
甘油会在组织的正常恢复过程中代谢吸收（通常在植入手术完成数天后）。
由于需要去除塞子，因此不建议对进行体内研究的探针进行预处理。
此外，一旦润湿，半透膜将变得更加柔软和难于操作。
对于体外研究，临时塞子必须在灌注液体前去除。
将探针浸入水、林格氏液或人工脑脊髓液中，同时灌注相应溶液30分钟（2μL/ min），即可除去甘油。
探测效率微透析采样通常不会在平衡条件下进行，因此探针内的溶液将与周围组织液产生浓度差。
灌注液的流速通常过快，使得它在探针内外样品浓度达到平衡之前带走样品。
透析液中分析物的浓度相对于样品基质中的浓度称为回收（recovery）。
结核分枝杆菌耐药检测技术选择——分子线形探针方法
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中盖项目
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耐多药结核鉴定药敏分子检测系统的选择
耐多药快速诊断需要同时对异 烟肼和利福平进行耐药检测
中国是TB和MDR-TB高负担国家； 异烟肼耐药率居首 利福平检测不能替代MDR检测
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WHO 政策声明
„…有充分的总括性证据证明关于在国家特定情况下快速 筛查MDR-TB使用线性探针方法的建议的合理性。“
2019/12/20
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21
杂交仪（手工,12条）
TwinCubator®
（可做12个条）
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杂交仪（全自动,48条）
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GenoType 系列产品可在同一平台（基于同一 种技术——DNASTRIP 技术）完成：6种 MTBC和30种NTM鉴定，MDR-TB和XDR-TB 药敏检测。
GenoType MTBDRplus是Genotype系列产品
分子线性探针虽然未能完全取代传统培养特别涂阴标本必须做培养但这种新技术大缩短等候的时间省略繁琐的操作流程幵提高了检测中的生物安全性26快速检测方法与传统方法对比传统法快速法实验方法pnbtch鉴别比例法绝对浓度法药敏实验genotypemtbdrplus样本要求固体培养物固体培养物涂阳标本或培养物固体液体鉴别mtbmbovis和ntm一二线药物耐药情况同时鉴定mtbc和利福平和或异烟肼耐药情况可确定是否为单耐或mdr48周48周6小时工作强度较大大一般8种药物最多可以完成30个样本人天小twincubator是12份样本规格全自动gtblot48是48跟样品规格结果判读bsl32肉眼读取菌落数bsl32肉眼读取菌落数肉眼试纸条条带安全性危险危险安全27中华结核和呼吸杂志28文献研究二lpa与bsctecmgit960比较
应用线性探针杂交技术快速检测结核分枝杆菌的多药耐药性
应用线性探针杂交技术快速检测结核分枝杆菌的多药耐药性张海燕;缪家文;潘洪秋;王捷婷;熊茜;宋戎;龚玉华;孙春红【摘要】目的:评价线性探针杂交技术(HAIN技术,GenoType MTBDR plus试剂盒)快速检测结核分枝杆菌多药耐药性的价值.方法:利用HAIN技术检测277例涂阳患者痰标本,并与比例法药敏试验作比较.结果:HAIN技术对肺结核患者耐多药的检出率和传统比例法药敏试验相比无显著差异(P＞0.05).HAIN技术检测耐利福平、耐异烟肼和耐多药结核的灵敏度、特异性分别为100％、81.69％、80.77％和100％、93.90％、95.74％.利福平耐药基因突变频率最高的是rpoB S531L位点[35/60(58.33％)];异烟肼耐药基因最常见的突变是katG S315 T1位点[42/71(59.15％)],其次是inhA c15t位点[23/71(32.39％)].结论:HAIN技术能快速、准确诊断结核分枝杆菌利福平、异烟肼的耐药性及多药耐药性.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(027)006【总页数】3页(P539-541)【关键词】耐多药结核病;线性探针杂交技术;利福平;异烟肼;耐药【作者】张海燕;缪家文;潘洪秋;王捷婷;熊茜;宋戎;龚玉华;孙春红【作者单位】镇江市第三人民医院检验科,江苏镇江212005;镇江市第三人民医院检验科,江苏镇江212005;镇江市第三人民医院肺科,江苏镇江212005;镇江市第三人民医院检验科,江苏镇江212005;镇江市第三人民医院检验科,江苏镇江212005;镇江市第三人民医院检验科,江苏镇江212005;镇江市第三人民医院检验科,江苏镇江212005;镇江市第三人民医院检验科,江苏镇江212005【正文语种】中文【中图分类】R521第5次全国流行病学抽样调查结果显示，我国每年约有10万新发耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）患者［1］。
线性探针技术原理
线性探针技术原理线性探针技术是一种用于解决哈希冲突（哈希碰撞）的方法。
在一个基于哈希表的数据结构中，当不同的键值映射到相同的哈希桶（槽位）时，就会发生哈希冲突。
而线性探针技术是通过逐个地检查下一个可用的哈希桶来解决冲突的。
在线性探针技术中，每个哈希桶都有一个状态位，用于表示该哈希桶是否已经被占用。
通常，空闲的哈希桶状态位为未占用。
当一个键值映射到一个已经被占用的哈希桶时，线性探针技术会顺序地检查下一个哈希桶，直到找到一个空闲的哈希桶。
具体地说，线性探针技术包括以下几个步骤：1.对键值进行哈希计算，得到哈希值。
2.将哈希值与哈希表大小取模，得到一个位置。
3.检查该位置的哈希桶状态位，如果为未占用，则将键值存储在该哈希桶中，并将其状态位设置为已占用。
4.如果该位置的哈希桶状态位为已占用，则顺序地检查下一个哈希桶，直到找到一个未占用的哈希桶。
5.将键值存储在找到的未占用的哈希桶中，并将其状态位设置为已占用。
然而，线性探针技术也存在一些问题。
首先，它可能导致聚集性，即连续的哈希桶被频繁地占用，导致性能下降。
其次，线性探针技术没有考虑到键值的相关性，即相似的键值可能会映射到相似的哈希值，从而导致冲突的概率增加。
最后，线性探针技术对于删除操作也存在一些困难，因为删除一个键值可能会产生空洞，即连续的未占用的哈希桶。
为了解决线性探针技术的问题，还有一些其他的解决方法，比如二次探测技术和双重哈希技术。
二次探测技术通过使用二次方程来计算下一个探测位置，从而减少聚集性。
双重哈希技术则通过使用两个不同的哈希函数来计算下一个探测位置，从而减少冲突的概率。
总之，线性探针技术是一种常用的解决哈希冲突的方法，其原理是通过逐个地检查下一个可用的哈希桶来解决冲突。
然而，线性探针技术也存在一些问题，需要配合其他的技术来进一步优化。
线性探针技术和传统基因检测技术在耐药结核病诊断中的可靠性和及时性对比
线性探针技术和传统基因检测技术在耐药结核病诊断中的可靠性和及时性对比韩珍;林日文;骆妙卡【摘要】目的：探讨线性探针(MTBDR plus)技术和传统基因检测技术在耐药结核病诊断中的可靠性和及时性。
方法同时采用MTBDR plus技术、核酸扩增检测技术和传统药敏实验方法对2014年1月至10月期间我院收治的246例涂阳肺结核患者的痰标本进行利福平和异烟肼耐药性的检测。
以传统药敏实验检测结果为金标准，分析MTBDR plus技术和核酸扩增检测技术诊断耐药结核病的准确性，并比较MTBDR plus技术和核酸扩增出报告时间。
结果 MTBDR plus技术检测所得利福平耐药结核病发生率、异烟肼耐药结核病发生率和耐多药结核病发生率分别为5.28%、7.32%和3.66%，和传统药敏实验检测所得的5.69%、6.91%和3.66%比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
核酸扩增检测技术检测所得利福平耐药结核病发生率、异烟肼耐药结核病发生率和耐多药结核病发生率则均低于传统药敏实验检测所得结果，差异有统计学意义(P<0.05)。
MTBDR plus技术检测利福平耐药、异烟肼耐药和耐多药的敏感度、Kappa值均高于核酸扩增检测技术，差异有统计学意义(P<0.05)。
MTBDR plus技术平均出报告时间为(1.26±0.58)d，显著低于核酸扩增的时间(8.89±1.08)d，差异有统计学意义(P<0.05)。
结论线性探针技术较传统基因检测技术可更及时、准确地诊断耐药结核病。
%Objective To study the reliability and timeliness of linear probe technique (MTBDR plus) and traditional genetic testing technique (TGTT) in diagnosing drug-resistant tuberculosis (TB). Methods MTBDR plus, nucleic acid amplification testing technique and traditional drug susceptibility experiment (TDSE) method were used at the same time in the rifampicin and isoniazid resistancetesting of sputum specimens of 246 smear-positive pulmonary tuberculosis patients in our hospital from January, 2014 to October, 2014. Taken the TDSE test results as the gold standard to analyze the accuracy of MTBDR plus and TGTT diagnosing drug-resistant TB and compare their report time. Results The incidence of Rifampin resistant TB, isoniazid resistant TB and mul-tidrug resistant TB tested by MTBDR plus technique were 5.28%, 7.32%and 3.66%, respectively, which had no statistical signifi-cance compared with the incidence tested by TDSE that were 5.69%, 6.91% and 3.66%, respectively (P>0.05). The incidence of Rifampin resistant TB, isoniazid resistant TB and multidrug resistant TB tested by TGTT lower than by TDSE, and the difference had statistically significant (P<0.05). The accuracy and Kappa value of diagnosing Rifampin resistance TB, isoniazid resistance TB and multi-drug resistance TB by MTBDR plus was higher than TGTT, and the difference had statistically significant (P<0.05). The average r eport time of MTBDR plus was (1.26±0.58) d, which was significantly less than (8.89±1.08) d of TGTT, and the difference had statistically significant (P<0.05). Conclusions Compared with the TGTT, MTBDR plus technique can more timely and accu-rately diagnose drug-resistant TB.【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】4页(P150-153)【关键词】线性探针技术;传统基因检测技术;耐药结核病;诊断;可靠性;及时性【作者】韩珍;林日文;骆妙卡【作者单位】惠州市结核病防治研究所，广东惠州516008;惠州市结核病防治研究所，广东惠州516008;惠州市结核病防治研究所，广东惠州516008【正文语种】中文【中图分类】R52;R446.62结核病(Tuberculosis，TB)是可造成人类死亡的常见感染性疾病，是全球公共卫生面临的重大威胁[1]。
分子生物学技术在结核病诊断及耐药检测中的应用
分子生物学技术在结核病诊断及耐药检测中的应用摘要】结核病是我国重点防治的重大传染性疾病。
目前耐药结核病、流动人口和HIV/TB双重感染已经成为结核病防控所面临的难题，其中结核杆菌耐药性是我国结核病防控中起着非常重要作用的因素。
结核病、耐药结核病的实验室诊断技术相对滞后。
亟需引进新的实验室技术辅助结核病、耐药结核病的诊断。
【关键词】分子生物学；结核病；应用【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）26-0069-02Xpert Mtb/RIF技术使用半定量巢氏荧光PCR，该技术针对结核杆菌利福平耐药基因rpoB基因区设定引物、探针，扩增荧光检测，其是否发生基因突变，检测标本中是否含有结核杆菌及是否对利福平耐药，整个实验过程需3小时左右。
线性探针杂交技术（Hain）检测技术直接从临床收集的病人肺部涂片阳性痰标本中提取核酸DNA、用生物素标记的引物进行多重PCR扩增和反向杂交。
通过检测rpoB基因突变（编码RNA聚合酶β-亚单位）确定对利福平的耐药性；通过检测katG基因（编码过氧化氢酶）和inhA基因的启动子区（编码NADH烯酰酸性磷酸酶还原酶）确定对异烟肼的耐药性。
从而，对来自培养物或病人肺部涂片阳性痰标本的结核分枝杆菌复合群及其耐利福平和/或异烟肼耐药基因进行分子生物学检测。
1.资料和方法1.1 标本来源2015年10月至2018年6月期间吉林市结核病防治研究所及所辖各县区结防所收治的疑似结核病患者共1345份痰标本。
1.2 检测方法对1345份痰标本进行荧光染色涂片镜检检测、结核分枝杆菌培养、结核杆菌比例法药敏，相关操作及结果判定。
其操作均按《结核病诊断细菌学检验规程》进行。
临床确诊肺结核病442例，对442例患者痰标本进行Xpert Mtb/RIF检测和线性探针杂交技术（Hain）检测，其操作均按试剂说明书进行。
2.结果2.1 1345例初诊肺结核可疑患者，经X线、CT、实验室检查，临床最终确诊肺结核病442例，确诊率为32.9%。
线性探针技术检测肺结核患者耐药情况临床评价
线性探针技术检测肺结核患者耐药情况临床评价侯婧;韩莙;张艳;孟婧【摘要】目的评价线性探针(HAIN)技术用于临床抗结核治疗的价值.方法收集251例痰抗酸杆菌涂片阳性肺结核患者的痰标本,以罗氏培养及药敏试验为\"金标准\",采用HAIN技术检测异烟肼及利福平的耐药情况.结果 HAIN技术对男性涂阳患者利福平(χ2=0.634,P=0.426)和异烟肼(χ2=0.951,P=0.329)的耐药检测,对女性涂阳患者利福平(χ2=0.174,P=0.676)和异烟肼(χ2=2.791,P=0.095)的耐药检测,以及全部涂阳患者利福平(χ2=0.806,P=0.369)和异烟肼(χ2=0.012,P=0.914)的耐药性检测效果与\"金标准\"比较,差异均无统计学意义(P>0.05).HAIN技术对利福平和异烟肼耐药检测的灵敏度分别为87.69％和57.73％,特异度分别为90.86％和87.24％.结论 HAIN技术能用于快速、准确地诊断利福平和异烟肼的耐药性,可作为辅助检测手段用于临床结核病尤其是耐药结核病的诊治.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2019(028)002【总页数】4页(P23-26)【关键词】线性探针;利福平;异烟肼;耐药性检测;实验诊断【作者】侯婧;韩莙;张艳;孟婧【作者单位】安徽省胸科医院,安徽合肥 230022;安徽省胸科医院,安徽合肥230022;安徽省胸科医院,安徽合肥 230022;安徽省胸科医院,安徽合肥 230022【正文语种】中文【中图分类】R446;R521耐药肺结核患者的治疗周期长、治疗成本高、治愈率低，该病患者的增多[1]，进一步增大了传播概率，也加重了社会的经济负担。
然而，传统的罗氏培养法培养结核分支杆菌需要8周[2]，进一步进行药物敏感性试验(简称药敏试验)诊断约需3个月，无法满足及时诊断和早期合理用药的需要[3]。
线性探针技术操作
10 个循环
10 个循环
20 个循环
30 个循环
1 个循环
1 个循环
扩增产物如果 不能及时杂交检测，短期4度保存。
12
杂交检测
区域：杂交区 设备：杂交仪，水浴锅，移液器（1000ul, 200ul, 20ul) 耗材： Tip头，废液缸，镊子，15ml离心管 试剂：Genotype 试剂盒，蒸馏水
13
杂交检测
化学变性
14
杂交检测
杂交（HYB和STR提前45度预热）
15
杂交检测
洗涤
16
杂交检测
耦合
17
洗涤3次
杂交检测
18
杂交检测
加底物显色液
19
杂交检测
洗涤
20
杂交检测
21
结果判读
CC：杂交对照
AC：扩增对照 TUB:鉴定结核分枝杆菌 复合群 3个区域: rpoB, , katG 和inhA 27 条带：5个对照条带
如果不能立即实验，-20度保存。
10
PCR扩增
每个病例取5ul DNA样本到扩增混合液中
11
PCR扩增
痰标本和菌株用不同程序
培养标本 15 min 95℃ 1 个循环 直接病人标本 1 个循环
30 sec95℃
2min58℃ 25 sec 95℃ 40 sec 53℃ 40 sec 70℃ 8 min 70℃ 4℃ 24 h
8
核酸DNA提取-痰
每管加150ul无菌蒸馏水。 95度水浴/金属浴20Min。 超声裂解15min。 12000rpm离心5min。 上清转移到1.5ml离心管。
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杂交检测
化学变性
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杂交检测
杂交（HYB和STR提前45度预热）
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杂交检测
洗涤
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杂交检测
耦合
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洗涤3次
杂交检测
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杂交检测
加底物显色液
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杂交检测
洗涤
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杂交检测
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结果判读
CC：杂交对照
AC：扩增对照 TUB:鉴定结核分枝杆菌 复合群 3个区域: rpoB, , katG 和inhA 27 条带：5个对照条带
4
试剂准备
扩增体系配制（50ul）
5
试剂准备
分装（45ul/样本）
如果 不能立即实验，-20度保存。
6
核酸DNA提取
区域：模板制备区 设备：生物安全柜、水浴锅、超声破碎仪、 离心机、移液器（1000ul，200ul，10ul） 耗材：一次性吸管，50ml离心管、管架， 1.5ml离心管、管架，Tip头，计时器，记号 笔，接种环，废液缸 试剂：消化前处理液（4%NaOH，2.94%柠 檬酸钠，NALC），无菌PBS，无菌蒸馏水
7
核酸DNA提取-痰
6%NaOH和2.94%枸橼酸钠等体积混合，配 制1%NALC前处理液。 取2ml涂阳痰标本转移到50ml离心管，加12倍体积前处理液，振荡30s,静置15分钟。 加PBS到45ml，3000g离心20min。 倒掉上清，加2ml PBS混匀沉淀，分别取 1ml转移到1.5ml离心管。 取1支管12000rpm离心5min，吸弃上清。
22
结果判读
结核分枝杆菌复合群
TUB显色；未显色判为未检测到MTB
敏感
所有野生探针都显色且所有突变探针都未显色
任一野生探针未显色或任一突变探针显色
耐药
23
结果判读
24
25
操作图谱
26
8
核酸DNA提取-痰5度水浴/金属浴20Min。 超声裂解15min。 12000rpm离心5min。 上清转移到1.5ml离心管。
如不能立即实验，标本-20度保存。
9
核酸DNA提取-菌株
每个培养阳性菌株取1平环菌株放入含 300ul无菌蒸馏水的1.5ml离心管。 85度灭活20min（生物安全柜内）。 95度水浴15min。 超声破碎20min。 12000rpm离心10min，上清转移到另一 1.5ml离心管，用于扩增。
结核分枝杆菌 线性探针耐多药检测方法
操作
试剂准备
核酸DNA提取 多重PCR扩增 杂交检测
2
Hain LPA 检测流程
3) 杂交 1) DNA提取
扩增产物和 固化在 膜上的特异性探针杂交
2) PCR扩增 4) 结果判读 利福平和异烟肼
3
试剂准备
区域：试剂准备区 设备：移液器（10ul, 20ul, 200ul,1000ul）， 振荡器，离心机 耗材：1.5ml离心管、管架，PCR管、管架， Tip头，废液缸 试剂：PNM试剂，热启动Taq酶试剂盒，分 子生物级H2O
如果不能立即实验，-20度保存。
10
PCR扩增
每个病例取5ul DNA样本到扩增混合液中
11
PCR扩增
痰标本和菌株用不同程序
培养标本 15 min 95℃ 1 个循环 直接病人标本 1 个循环
30 sec95℃
2min58℃ 25 sec 95℃ 40 sec 53℃ 40 sec 70℃ 8 min 70℃ 4℃ 24 h
10 个循环
10 个循环
20 个循环
30 个循环
1 个循环
1 个循环
扩增产物如果 不能及时杂交检测，短期4度保存。
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杂交检测
区域：杂交区 设备：杂交仪，水浴锅，移液器（1000ul, 200ul, 20ul) 耗材： Tip头，废液缸，镊子，15ml离心管 试剂：Genotype 试剂盒，蒸馏水