层析填料选择

24 / GE /
Capto™ Impres
－－中度以及精细纯化的快流速高分辨率填料
Capto™ Q / SP ImpRes:
HiScreen Capto Q ImpRes
HiScreen Q HP
–颗粒直径~40µm，高分辨率 –良好的压力流速性质 –工艺设计方便 –较宽的操作窗口易于线性放大 –高生产通量 –提高生产效率
Sephacryl S系列填料
－经济的高分辨率填料
Kav
1.0-
Sephacryl S系列有6种不
0.8-
同分离范围（1000-108
），提供广阔的选择性
0.6-
，甚至可分DNA质粒和
病毒，经济、高效，易
0.4-
于自wk.baidu.com装柱，是
0.2-
7 Superdex外作下游纯化
1
24 5 3 6
的理想介质
1000 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000
• 高盐吸附 • 新的选择性
28 / GE /
Layered beads-Two Examples
Shell Beads
• Ligand only in outer layer (shell) of the bead • Active surface, inactive core
第一代凝胶过滤填料： G-10 分离范围： <700 G-25 分离范围：1000－5000 G-50 分离范围：1000－30000 Sephadex LH-20分离范围:<5000
8/ GE /
Superdex 系列填料
－最受欢迎的凝胶过滤填料
特点：结合了Sephadex的高选择性 和琼脂糖的高物理稳定性，机械稳 定性好,高分辨率高化学稳定性
1. Superdex™ Peptide 2. Superdex 75
3. Superdex 200
4. Sephacryl™ S-100 HR
5. Sephacryl S-200 HR 6. Sephacryl S-300 HR
7. Sephacryl S-400 HR
10 / GE /
Sepharose 系列填料
50周年
－快速group separation首选 1959-2009
Sephadex 是由葡聚糖 交联环氧氯丙烷形成 的多孔结构
Sephadex: 羟基基团， 呈弱酸性
Sephadex : Separation Pharmacia Dextran
7/ GE /
Sephadex 系列填料
－快速group separation首选
Q Sepharose™ Fast Flow SP Sepharose™ Fast Flow Etc
Affinity
MabSelect™ Blue Sepharose
(Biorecognition) Etc 26 / GE /
CaptoTM adhere
－－多模式新型强阴离子交换填料
OH
OH
+
+
O
15 / GE /
离子交换（IEX）－最受欢迎的层析方法
原理：根据生物分子的表面电荷性质进行分离纯化， 可以应用在层析的各个阶段。
重点：在于选择合适的分辨率。
16 / GE /
离子交换填料的分类
基本形式：
R（带电配基）
基架类型： – Sepharose 基架 – Source 基架 – Capto 基袈 – Sephadex基架 – 纤维素基架
层析填料选择 Media Selection
Sephadex
Sepharose
Sepharose FF Superose
Sepharose HP
Sepharose CL
Superdex Sepharose Big beads Streamline
Mono beads Sephacryl
Sepharose XL
Flow velocity in a 1 m diameter column (cm/h) 700
240
Measured flow velocity for Capto Q at 3 bar with 20 cm bed height in FineLINE™ 100: 850 cm/h
Medium Capto
3/ GE /
如何选择层析填料
•按照层析技术原理分类选择填料 •层析工艺不同阶段选择填料的一般规律 •根据目的物的性质选择填料 •根据规模选择合适的层析预装柱 •层析空柱选择
4/ GE /
按照层析技术原理分类选择填料
• 凝胶过滤填料选择 • 离子交换填料选择 • 亲和填料选择 • 疏水填料选择 • 反相填料选择
HiScreen Capto Q
HiScreen Q FF
25 / GE /
Capto基架系列离子交换填料 ----多模式的离子交换填料
HIC/RPC
(Hydrophobicity)
Ion exchange (Charge)
Phenyl Sepharose™ HP SOURCE™ 15RPC Etc
MacroCap SP
－－专为较大的生物分子设计的阳离子交换填料
•特别适合PEG修饰后的蛋 白的纯化 •基架：交联的烯丙基葡聚 糖与氮氮亚甲基丙烯酰胺 •颗粒大小：平均50um •动态载量：4mg/ml填料
20 / GE /
Source基架离子交换填料
－－高流速、低反压、高分辨率
化学材质：聚苯乙烯/二乙烯苯 颗粒均匀，硬度大，排阻极限可达107
SOURCE Capto sepharo新se一代填料是 什么呢？
1960
1970
1980
1990
2000
填料的基本特点
• 五大类层析技术 – 凝胶过滤 (GF) – 离子交换 (IEX) – 亲和层析 (AC) – 疏水层析 (HIC) – 反相层析 (RPC)
• 基架 - 颗粒越细、大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较高 (SOURCE基架例外)
－快速大分子凝胶过滤首选
• Sepharose的结构：
β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线 性多聚糖。 在形成过程中由单独的多糖链先形成双螺旋，然后聚 集成胶束，胶束之间形成微孔，其大小取决于胶束的 多少，即琼脂糖的浓度。 pH为4-9之间稳定。 琼脂糖凝胶对样品的吸附 作用很小，并且机械强度 和孔穴稳定性都很好。
Bed height (cm) 45
Flow velocity in a 1 m diameter column (cm/h)
350
Sepharose 6 Fast Flow
45
~25
Measured flow velocity for Capto Q at 3 bar with 45 cm bed height in FineLINE 100: 600 cm/h
High load in flow-through mode (100 - 300 mg MAb/ml) Contaminant removal to formulation level in two chromatographic steps
27 / GE /
Capto MMC
－－耐高盐浓度的弱阳离子交换凝胶
Sepharose: Separation Pharmacia agrose
11 / GE /
Sepharose 系列填料
－快速大分子凝胶过滤首选
• Sepharose 2B/4B/6B：分离范围10K-40000K 适合分离分子量大小差异大，对分辨率要求不高的 样本。如核酸、蛋白多糖等。
• Sepharose CL 2B/4B/6B： Sepharose与2,3-二溴丙醇共价交联得Sepharose CL， 适合有机溶剂纯化。主要用于核酸、蛋白多糖分离等
型号 Superdex peptide
Superdex 30 prep grad Superdex 75 Superdex 200
分离范围 100－7000
<10000 3000－70000 10K-600K
mAU
1500
dimer
1000
monomer
500
0
9/
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25G.0E / ml
• Sep。harose 6FF：分离范围10KD-4MD Sepharose 4FF：分离范围60KD-20MD 适用于巨大分子如多糖疫苗、病毒、乙肝表面抗原、 DNA质粒纯化。
12 / GE /
Superose系列填料
－分离范围最宽广的高分辨率凝胶过滤填料
•Superose 6分离范围：5k-5000K •Superose 12分离范围：1K-300K
5/ GE /
凝胶过滤（GF）填料选择
•原理：是根据分子量大小分 Gel structure 离物质的一种层析方法。 •精度：分子量差别一倍以上 •重点：选择分离范围
•类型：Sephadex、Superdex、Sephacryl、 Sepharose、Superose
6/ GE /
Sephadex 系列填料
－－新一代快流速高载量填料
+
基架
表面延伸剂
+O
-
SO3
配基:磺酸乙烷基
• 改良交联琼脂糖---刚性更强、传质速度更快 • 线状葡聚糖表面延伸剂---载量提高 • 颗粒大小：平均90um,75um,40um • 配基：Q、S、DEAE、Adhere、MMC、ImPres
22 / GE /
Capto基架刚性更强
•高流速、低反压
•高载量
Capto™ Q and Sepharose™ 6 Fast Flow in BPG™ 300, 20 cm bed height
23 / GE /
Capto基架刚性更强
－－更宽的工作范围
Medium Capto Sepharose 6 Fast Flow
Bed height (cm) 20 20
3um具有极高分辨率，常用于分析
10um具有很高分辨率，用于微量制备
15um具有较高分辨率，用于精细纯化 使用流速30－600cm/hr
30um具有较高分辨率，流速快 使用流速300－1000cm/hr
Mono P：专为层析聚焦设计的弱阴离子交换填料 21 / GE /
Capto基架系列离子交换填料
• 物理稳定性 - 新一代介质较坚固，能承受高流速，同时保持 柱床体积和结构稳定，省却每次重新装柱，提高重复性
• 化学稳定性 - 新一代介质能承受极端pH，高盐度，促溶剂 和有机溶剂，利于开发分离条件和在位清洗(CIP)，大大延长 介质寿命并提高重复性
如何选择层析填料
•按照层析技术原理分类选择填料 •层析工艺不同阶段选择填料的一般规律 •根据目的物的性质选择填料 •根据规模选择合适的层析预装柱 •层析空柱选择
mg BSA/ml
250
200
150
100
50
0 ABCDEF
A = Macroprep High Q B = Fractogel EMD, TMAE 650 C = SuperQ 650 D = Q HyperD E = STREAMLINE Q XL F = Q Sepharose XL
19 / GE /
O
N
OH
CaptoTM High flow agarose
N-Benzyl-N-methylethanolamine
Removal of Leached Protein A Dimers and aggregtes Host cell proteins Viruses
Nucleic acids ... preferably in flowthrough mode.
17 / GE /
Sepharose基架离子交换填料 －－市场主流
34um
Q、SP Sepharose High Performence
小高
Q、SP、DEAE、CM、ANX DEAE、CM
90um Sepharose Fast Flow
Sepharose CL-6B
Q、SP
100-300um
Sepharose Big Beads
13 / GE /
吸附层析填料设计
基架
•机械稳定性 •化学稳定性 •柱效/分辨率 •表面特性 •压力/流速特性
配基
O SO O
•色谱模式 •选择性 •载样量 •化学稳定性
14 / GE /
按照层析技术原理分类选择填料
• 凝胶过滤填料选择 • 离子交换填料选择 • 亲和填料选择 • 疏水填料选择 • 反相填料选择
Sreamline SP and DEAE
分 颗辨 粒率
大
低
18 / GE /
Q、SP Sepharose XL
－－超高载量填料 XL
XL介质拥有琼脂糖骨架配合葡 萄糖长链，大大增加高流速下 的动力载量大大减少柱床体积， 降低放大工艺时的成本。
新一代层析介质挑战载量极限！
•载量可比一般介质高达10倍！1ml Q Sepharose XL 可载 250mg BSA！