质粒拷贝数的测定方法

生物技术通讯

LETTERS IN BIOTECHNOLOGY

1999年 第10卷 第1期 Vol 10 No.1 1999

质粒拷贝数的测定方法

周 涛

摘要 在研究生物工程重组蛋白产量的过程中，质粒的拷贝数是一个

需要重点考虑的参数，对它进行精确定量至关重要。本文概述了几种

主要的测定方法的原理和特点。

关键词 质粒拷贝数；测定方法

Determination methods of plasmid copy number

Zhou Tao

(Institute of Biotechnology, Beijing,100071)

Abstract Plasmid copy number, the number of expression vectors in each cell, is a key parameter in the study of productivity of recombinant

microorganisms. Recognition of the importance of this parameter has given

rise to a number of methods for its determination. this article focuses on the principles and charactistics of these methods.

Key words plasmid copy number; determination method

细菌质粒是双链、闭环的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒在一般情况下对宿主细胞的生存

不是必需的，但质粒含有某些基因，可以补充细菌基因的不足，有利

于细菌的生存。质粒DNA的复制要由复制细菌染色体的多种酶共同完

成，在宿主中复制的程度差异很大。质粒拷贝数指的是每个细胞中所

含的质粒的个数。低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1～2次，而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10～200拷贝。

质粒的拷贝数依赖于各种胞内外因素：质粒拷贝数首先决定于自

身的遗传性，控制质粒拷贝数的基因位于一个包括DNA复制起点在内的质粒DNA的区域内。其次，质粒的拷贝数也受细胞生长条件的影响。细胞的生长速率增大时，质粒的拷贝数下降，主要是因为在高比的生长

速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从而质粒拷贝数不

断下降［1］。此外，培养时的温度和培基的组成都对质粒拷贝数有影

响，比如当营养物限制或缺乏时会使质粒的拷贝数下降［2］。为了降

低高拷贝数质粒的代谢负担，Remaut等构建了一种所谓潜复制的质

粒，在正常情况下每个细胞只有1个拷贝，经诱导后其浓度可达到每个细胞1000拷贝［3］。

一般来说，外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高，但是当拷

贝数很大时，拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在了［4］。这主要有两方面的原因：一方面，高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定，可能是由转录和翻译水平决定的；另一方面，高拷贝数的质粒往往很不稳定。由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关，因此对于重组蛋白的生产来说，质粒的拷贝数是一个非常重要的参数。那么迫切需要解决的问题就是如何准确地测定胞内质粒的拷贝数。现在已经发展了一些测定的方法，大致可以归纳为两类：一类是直接进行测定的方法，包括一些物理分离的方法和杂交的方法；另一类就是间接测定的方法。下面对这些方法做一个简单的介绍。

1 物理分离的方法

物理分离的方法就是将质粒DNA与染色体DNA进行分离并定量。将质粒DNA与染色体DNA分开主要是基于质粒DNA的两大特性：①质粒DNA 是以共价闭合环状的形式存在，与染色体DNA的线状形式不同；②质粒DNA的分子量比染色体DNA要小得多。这些方法主要包括：氯化铯-溴化乙锭平衡梯度离心法、凝胶电泳法、高效液相色谱法以及毛细管电泳法等。

1.1 氯化铯-溴化乙锭（CsCl-EB）平衡梯度离心法

CsCl-EB平衡离心法是早期经常采用的方法，这种方法分离质粒和染色体DNA，是因为EB与线状和闭合环状DNA分子的结合量有所不同。EB通过嵌入碱基之间与DNA结合，进而使双螺旋解旋，由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了EB分子的继续嵌入。但线状分子则不受限制，可继续结合更多的染料，直至达到饱和，即每两个碱基对大约结合一个EB分子。正是由于染料结合量的差别，使得线状和闭环DNA分子在含有饱和量EB的CsCl梯度中的浮力密度有所不同，从而达到分离的目的。

如果在细菌的培基中预先加入放射性标记的物质，那么根据回收的DNA条带的放射性强度可以进行定量分析。1965年，Dewitt在CsCl梯度离心后采用了分部收集的方法，将离心后的产物按密度梯度由高到低分成若干个部分，每部分取出一定的量进行液闪测定。如图1所示，浮力密度由右到左逐渐增大，前面的“卫星”峰即为质粒DNA峰。而且分部越细，测定结果的精确度越高。Clewell及其同事利用这种方法进行了大量的试验，发现放射性物质的回收率有很大的差别，从68%到90%不等［5,6,7］。根据质粒DNA峰的面积与染色体DNA峰面积的比值即可计算质粒的拷贝数。

图1 CsCl-EB平衡梯度离心法分离菌株S.faecalisDS-5 DNA粗提液

［5］

CsCl-EB梯度离心法一般需要在超速条件下离心较长时间，比如用垂直转头UTi65需要以45 000 r/min离心16 h，用角转头则时间更长，Ti50以45 000 r/min离心48h，Ti65以60 000 r/min离心24 h，Ti70.1以60 000 r/min离心24 h等等，因为只有这样才能获得较满意的密度梯度。

用CsCl-EB梯度离心法来测定最大的缺点就是分部困难，回收率不稳定，并且十分费时，因此一般都不用来定量，而只做纯化回收质粒之用。

1.2 凝胶电泳（Gel electrophoresis, GE）

琼脂糖和聚丙烯酰胺是常用的两种凝胶基质。聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5～500 bp）效果最好，分辨力极高，相差1 bp的DNA片段就能分开。琼脂糖凝胶的分辨能力比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广，从200 bp到50 kb，同时琼脂糖凝胶的制备与操作都比聚丙烯酰胺凝胶容易，因此，分离DNA通常都采用琼脂糖凝胶电泳。

由于在中性pH的电泳缓冲体系中，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动，迁移率的大小与DNA分子大小及立体构象有关。并且在相同电泳条件下，按照Modsnad模型，小分子是以直线泳动的， 而大分子则以曲线泳动，因而小分子泳动速度较大分子迅速，这样，质粒DNA与染色体DNA就得到了分离。Wesblum［8］等首先利用了凝胶电泳的这一特性来测定质粒的拷贝数。他们将培养物进行放射性标记，凝胶电泳后测定各条带的放射性强度。Projan［9］等人采用荧光标记DNA，通过测定标记物的荧光强度代替测定放射性强度，从而扩大了这一方法的应用范围。

测定荧光强度来确定质粒的拷贝数的方法主要有3个步骤：①琼脂糖凝胶电泳分离细胞裂解液；②溴化乙锭染色；③色谱扫描仪扫描电泳条带。可以直接扫描凝胶，也可以扫描凝胶照相后的底片，但无疑