ch02柱色谱法分离甲基橙和亚甲基蓝

柱色谱：1905 年俄科学家茨维持首次采用 装有碳酸钙的柱子，分离叶绿素获得成功 而创立了柱色谱法。 分类：常用的有吸附色谱和分配色谱两类。 前者常用氧化铝或硅胶为吸附剂。后者以 硅胶、硅藻土等为支持剂，以吸收大量的 液体为固定相。（答1）当加入洗脱剂时，由 于不同化合物吸附能力不同，因而以不同 的速度沿柱向下流动，继续洗脱时，吸附 能力弱的组分随溶剂首先流出。在连续洗 脱过程中，不同组分或不同色带就能分别 收集，从而达到分离纯化的目的。
实验二 柱色谱法分离甲基橙和甲基 蓝
一、实验目的
1. 了解柱色谱的分离原理。 2．掌握柱色谱法的实验操作技术。
二、实验原理
甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂,它们的结构式如下所示: 甲基橙 亚甲基蓝
由于甲基橙和亚甲基蓝的结构不同,极性不同,吸附剂 对它们的吸附能力不同,洗脱剂对它们的解析速度也不 同,极性小、吸附能力弱、解析速度快的亚甲基蓝先被 洗脱下来，而极性大、吸附能力强、解析速度慢的甲基 橙后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。本实验以 中性氧化铝为吸附剂，95%乙醇作为洗脱剂，先洗出亚 甲基蓝，再用蒸馏水作洗脱剂把甲基橙洗脱下来。

柱色谱与薄层色谱来自百度文库间的区别与联 系（答2）
薄层色谱和柱色谱不同点：固定相的形 状和展开剂的移动方向 薄层色谱和柱色谱相同点：在分离原理 上基本相同。

3、柱色谱（柱层析） （1）在薄层色谱的基础上，进行混合物的分离 （2）分类：吸附型（Al2O3、硅胶G等作吸附剂） 分配型（硅藻土、纤维素等作支持剂）（答6） （3）吸附柱色谱 1）吸附剂：一般采用表面积很大，经过活化的多孔 性或粉状的固体 氧化铝（酸性、中性、碱性）3种（答7） a、用前应纯化并在105-110℃活化0.5h，于烘 箱中自然冷却 (答8) b、吸附剂用量 被分离样品的量与吸附剂用量之比 被分离样品：吸附剂量=1：30-40或100倍(答9）
思考题 1.薄层色谱的铺板要领是什么？ 2涂层的均匀度对实验有何影响？


六、注意事项
1、吸附剂的选择和活化 2、洗脱剂的选择： 对未知样品先用极性小的溶剂洗脱， 再用极性大的溶剂洗脱 3、装柱的技术：松紧度 4、吸附剂的用量： 5、柱高：柱子太高洗脱慢
思考题 （1）装柱不均匀或有气泡，裂缝，将会造成什么后 果？如何避免？ （2）极性大的组分为什么要用极性较大的溶剂洗脱？ （3）在氧化铝柱子上若分离下列各组混合物，哪一 个组分先被洗脱下来？
实验步骤（续）

加样：当乙醇液面刚好流至石英砂平面相切时， 立刻关闭活塞，向柱内滴加10滴甲基橙和亚甲基 蓝的混合物（乙醇溶液），打开活塞。 洗脱：待液面降至石英砂层时用少量95%乙醇洗 下附在管壁的色素（少量多次），然后用95%乙 醇作为洗脱剂，控制流速（约为1滴/秒），当亚 甲基蓝色带洗出时，更换锥形瓶收集洗脱液，直 至洗脱液无色。更换锥形瓶，并改用蒸馏水继续 洗脱，用另外的锥形瓶收集，直到甲基橙全部被 洗脱下来。
实验二 柱色谱法分离甲基橙和 亚甲基蓝＆硅胶粘合薄 层板的铺制
指导老师 黄红霞
色谱法是分离纯化和鉴定有机物的重 要方法之一。 色谱法可分为柱色谱、纸色谱、薄层色 谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
思考题：
1、色谱法的基本原理? 2 、柱色谱与薄层色谱之间有怎样的区别与联系 3 、如何选择洗脱剂？ 4 、装柱时，应该注意哪些问题？ 5、 色谱柱一般的直径和高度比例是多少? 6 、柱色谱分为几类?分别用什么作吸附剂? 7、 常用的三氧化二铝吸附剂分为几种? 8、 吸附剂在使用前必须如何处理? 9、 被分离样品的量与吸附剂用量之比是多少? 10、 洗脱时要注意些什么 ?

薄层色谱法的主要类型和吸附色谱原理


吸附薄层色谱法
原理：组分在薄层板上吸附、解吸附、 再吸附、再解吸附的过程。 吸附系数不等实现分离。
一般极性强的组分K大，Rf值小；极性弱的组分
K小，Rf值大。

分配薄层色谱法
吸附薄层色谱的吸附剂



吸附剂 硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。 原理：硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键 （吸附性）。 组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同 而分离。 应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、 醛类等 硅胶活度与含水量的关系：含水量高，活性级高， 活度低。 活化：加热至105℃左右，除去吸附水提高活度。 （注意温度不可过高）





洗脱时应注意：（答10） （1）向柱内加入95%乙醇溶液洗脱（可以通过注射器沿管 壁或安装滴液漏斗）在恒压或加压条件下进行洗脱。控制 流出速度1滴/秒。逐渐出现色层带分离。 （2）第一色层带到达色谱柱底部时，立即用锥形瓶收集第 一色层的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脱时切勿 使溶剂流干！ （3）然后，改用水溶液作为洗脱剂，当第二色层带到达色 谱柱底部时，立即收集第二色层的的溶液，直到其完全被 洗出。 （4）用量筒分别量取所分离出来的两种溶液的体积后，倒 入指定的回收瓶中。 （5）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸 耳球从活塞 向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使 用过的吸附剂倒入垃圾桶里。
操作步骤
粘合薄层板的铺制：
称取羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 0.75g，加 入100ml水中加热使溶解，放冷，放置后取 13ml,再分次加入硅胶5g，调成糊状后倒在清 洁的玻璃板上，可幌动或转动玻板，使其均 匀流布于整块玻板上，而获得均匀的液层。 将玻璃平放晾干，然后于110℃活化40分钟， 置干燥器中贮存备用。
和
和
完！
硅胶粘合薄层板 的铺制
薄层色谱基本原理
薄层色谱（Thin Layer Chromatography） 常用TLC表示，它是将固定相均匀地涂 在薄板（如玻璃板）上，依靠毛细作用 力或重力，使流动相通过固定相的一种 色谱。
特点：
快，需十至几十分钟，同时展开多个 试样。 试样预处理简单，对试样限制少。 载样量比较大，适用于制备。 仪器简单，操作方便。 分离能力较强。 灵敏度较高。
常用洗脱剂的极性：

石油醚＜ 环己烷＜ 四氯化碳＜ 甲苯＜ 苯 ＜ 二氯甲烷＜ 氯仿＜ 乙醚＜乙酸乙酯＜ 丙酮＜ 乙醇＜甲醇＜ 水＜ 乙酸
装柱时应该注意的问题（答4）

装柱时应该注意均匀，不能有气泡，裂缝， 否则样品可能顺缝隙流动而不吸附，影响 样品的分离，应用质软的物体如吸耳球等 轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密，排 除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无 凹凸面．
2）样品： 3）洗脱剂：溶剂的结构与吸附能力的关系 化合物的吸附性与它们的极性成正比即
极性大吸附力强，后洗脱。
洗脱剂的选择（答3） 第一，先极性小的，再极性大的 可以是单一溶剂，也可是混合溶剂 第二，溶剂纯度要高并经干燥过的 4）色谱柱的装填分为： 干法和湿法两种（今天用湿法） 柱高和柱直径之比=7.5 ：1（答5）
三、仪器和试剂 1.仪器 锥形瓶、玻璃漏斗、色谱柱 2.试剂 中性氧化铝、石英砂、乙醇（95%）、 甲基橙、亚甲基蓝

四、装置图
洗脱
装柱
五、实验步骤

装柱：
（1）取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱 脂棉花将色谱柱垂直固定在铁架台上，关闭活塞
(2) 填固定相：向柱中加入已经润湿的 Al2O3 （7g Al2O3+95%乙醇拌匀）至柱体积的1/2 （3）用洗耳球敲打柱身使氧化铝装填紧密，打开 活塞，用小锥型瓶承接, 控制滴速为1 滴/秒,装完 后在上面加一层石英沙（约5mm）。操作时要注 意吸附剂始终不能露出液面。