脑缺血MCAO模型制作及注意事项

脑缺血MCAO模型制作及注意事项

广州佳灵生物技术有限公司

术前准备：

线栓：

目前市场上主要有硅胶和多聚赖氨酸两种材质的线栓，另外还有不多的石蜡线栓和指甲油等线栓。强烈建议大家采用硅胶线栓（可购买广州佳灵生物技术有限公司的硅胶线栓，质量堪比进口线栓，模型质量高），国外很少看到有用多聚赖氨酸线栓的。这是因为多聚赖氨酸对血管内皮细胞损伤严重，容易引起血小板聚集，导致血栓形成，因此拔出线栓后，用多普勒血流仪检测血流的恢复程度，每只动物血流恢复的程度差异很大（0-70%之间），最终导致梗死差异大。也有部分动物模型是非再灌模型。

体重与栓线直径：参照佳灵公司的产品介绍（附件1）。

麻醉剂：

常用的麻醉剂有：异氟烷（安全性高，撤去麻醉面罩后，动物2分钟可清醒，但是需要配麻醉机，并且异氟烷损耗大，成本较高）、水合氯醛（安全性较好，控制好量可以连续麻醉3 h，缺点是误打入肠道后可引起肠梗阻，导致动物死亡；对动物的提问下降比较明显，需要控制好动物的体温）。手术器械：工欲善其事必先利其器，实验专配的镊子、剪刀等器械可大大提高实验效率（有些人30分钟一只模型，有些人5分钟一只模型，除了技术水平的差异外，也与手术器械是否顺手有莫大关系）。广州佳灵生物技术有限公司为脑缺血模型实验准备了专用的器械包，可购买。

保温设备：60W白炙灯照射或者放置于保温垫上，使肛温保持在 37℃。温度对梗死大小影响非常显著（温度越低，梗死越小），北方的实验室，尤其是冬天做实验的时候，一定要注意保温。

TTC的配制：用0.2mol/L磷酸缓冲液（PBS）配成0.5-2% TTC溶液（pH7.5），避光保存。

实验方法：

动物用10％水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉。仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA 远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。（不可不扎，否则出血较多。但不可过紧，否则插线困难）用眼科镊轻推拴线（线栓是分几次一点点插进去的，而不是夹住线栓的中间部分一下子插进去的。说线栓太软不好用的，都是试图一下子插进线去的，这是错误的），直到遇到轻微阻力停止插线，紧紧系牢CCA远心端的细线（动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败）。血管外的栓线不要留得过长，避免大鼠醒来后会自己拔出。缝合伤口，单笼饲养观察（单笼饲养可避免动物间相互踩踏，提高存活率）。如果需要再灌的话，就把拴线抽出即可（线栓可不比全部拔出，把到硅胶线头到结扎的位置，遇到阻力就好了。全部拔出来往往会出血）。拔线的时候，务必确保动物是出于麻醉状态的（清醒状态下拔线，动物死亡率在80%左右，记住了吗？？）。

注意事项：

1、分离时要层次清楚：正中剪开SD大鼠颈部皮肤，分离皮下结缔组织时会发现该组织与颈部两侧鼓泡腺体（很多人误认为那是甲状腺）结合紧密，因此不必分离过于太细，直接在正中两侧鼓泡腺体之间分离，这样能不接触胸锁乳突肌而直接暴露颈前颈群且不会损伤腺体造成过多出血。下一步是分开颈前肌群，这时候要注意用小钳子作撑开分离动作要在左右肌肉块之间而不是一块肌肉的肌纤维之间，虽然它们看起来很模糊，但这样能保证不会出现较多条索状细肌纤维条影响下一步颈内动脉的寻找与分离，并且能整块地向一侧牵开颈前肌群暴露颈动脉鞘。见到颈动脉鞘了则要注意细致分离迷走神经，若损伤则可能影响其呼吸而死亡的。

2、分离血管时，要尽量将血管剥离的干净些，这样在用眼科剪剪口时就不会误剪外膜（误剪的话再剪就很容易把口剪大了或者剪断了，要注意口子越小越好插线），且要剪一个斜行的切口（眼科剪与血管约成45度），这样在血液刚流出时仍能看上翻的断口管壁，这样即容易插入栓线且血管受得了插线时一定的牵拉。当然，切勿牵拉过猛，以免使血管发生痉挛，导致栓线不能顺利进入。

3、注意尽量不要损伤神经。

4、栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了，有时候很顺利一插到底，但有时候在中间就怎么

也进不去了，这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度。因此，碰上这种明显阻力时，一定不能盲目向前使力插，越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管。这时候正确的作法是往外抽出较多栓线，也许会有一定的动脉血流出，不必慌，只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲，一般都能进去，反复试几次还不行最好换根栓线，很可能前端也经变形角度变了！颈内动脉的走向为内上方，可以用镊子夹住鱼线插,但进去后要注意，别太用力，要不血管就要破了。

5、栓线不能在血管里反复进退，否则及容易造成蛛网膜下腔出血，而且很容易误解为模型成功，因为这时的神经功能改变也很明显，但并不是由于栓塞引起的。

6、进线时，使栓线有一定程度的弯曲，且只要保证栓线向屋顶方向弯曲，一般都能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。

7、术后一定要注意保暖。

8、性激素对脑梗死面积有较大影响，应采用单一性别的动物进行实验。

9、大鼠大脑中动脉永久性闭塞性脑缺血模型，梗死体积出现的最小时间点可能为2 h，体积随时间进行性增大，至12h基本趋于稳定

10、对于插线已经熟练的操作者来说，如果一次遇到大多数动物插不进线去或者死亡率特别高，就要考虑是否是动物的问题。动物往往出现血管变异，尤其是饲养很久的动物。动物来源对死亡率影响很大。

舍去标准：

1、栓线插入深度不足18 mm,且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠

2、蛛网膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis环动脉有凝血块的大鼠，因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤，而非MCAO/Reperfusion损伤。

3、手术时出血较多，症状很重的动物。

死亡原因分析：

1、首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是插线太深，以后注意插线深度；