组培继代培养

继代培养

继代培养：对培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养。

（一）组织培养时，植物激素的使用规律

在生长素存在的条件下，细胞分裂素的作用有加强的趋势，但二者在使用上有一定的顺序关系，处理顺序不同，培养物的分化状态也不同。规律如下：

⑴先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细胞分裂，但细胞不容易分化,容易产生多倍体细胞。

⑵先用细胞分裂素处理，后用生长素处理，细胞分裂也分化。

⑶用生长素和细胞分裂素同时处理，细胞脱分化后分化频率提高。但二者的使用浓度比值可以决定器官分化方向：生长素/细胞分裂素比值高时，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值适中时，促进愈伤组织的形成和生长。

1、愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程收继代。继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。

2、通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保存持在不分化的增殖状态。

提高增殖率的方法

（一）选用最佳的培养基

1、促进腋芽形成与生长调节物质。

促进芽丛生长的培养基：加入0.1～10.0 mg·L-1的细胞分裂素，偶然也用较高浓度。应用最多的是6-苄基氨基嘌呤（BA），其次是激动素（6-糠基腺嘌呤，KT）和2-异戊烯基腺嘌呤（2ip），玉米素（ZT）用的较少；

除细胞分裂素以外，培养基中还经常加入低浓度的生长素，以促进腋芽的生长，但要防止愈伤组织化。常用和生长素是NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IAA（吲哚乙酸），浓度在0.1∽1.0mg.L-1。

☐培养基中还经常加入低浓度的生长素，以促进腋芽的生长，但要防止愈伤组织化。

常用的生长素是NAA、IBA、IAA，浓度在0.1∽1.0mg.L-1。

☐有时还加入低浓度的GA3（赤霉素），以促进腋芽的伸长。

2、诱导不定芽的形成与生长调节物质。

☐诱导外植体形成不定芽时，一般使用细胞分裂素的浓度高于生长素浓度的配比，但也经常采用细胞分裂素和生长素浓度的比值接近于1的配比。

☐常用的细胞分裂素是BA、KT和玉米素，浓度在0.1∽10.0 mg.L-1。有的还加入低浓度的2，4-D才能诱导不定芽的产生

3、促进胚状体的形成和增殖与生长调节物质。

☐由体细胞形成的胚状体叫体细胞胚（Somatic embryo）。

☐生长素在体细胞胚胎发生中起着重要作用。一般是在含有丰富还原氮的培养基上，加有生长素，特别是2，4-D以诱导胚状体的发生，然后转移到降低浓度或没有生长素的培养基上使其成熟、萌发和生长。

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继代增殖培养应注意的问题

分化再生能力衰退现象

1、经多次继代后，会逐渐减少或丧失愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的

成器官中心（分生组织），导致维管束难以形成，只能保持无组织的细胞团。

也有人认为在继代过程中，逐渐消耗了母体中原有与器官形成有关的特殊物质。

2、衰退可能也与内源生长调节物质的减少或丧失有关。

3、可能是细胞不正常染色体聚集导致形态发生能力的丧失。

4、植物材料

5、培养基及培养条件

6、继代培养次数

7、季节

驯化现象

在植物组织培养中，发现一些植物组织经长期继代培养，发生了一些变化。开始继代培养要加入生长调节物质，其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长、这种现象称为“驯化”（acclimation）。