一组织培养——培养基的配置
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植物组织培养
第一节 培养基的配置
一、定 义
• 人工配制的
• 微生物或动植物细胞
• 生长繁殖或积累代谢产物
• 营养基质
二、培养基的组成成份
• 无机成分： 大量元素：氮： 铵态氮、硝态氮混合 磷： 磷酸盐 钾： 钾盐 钙、钠、镁、硫 微量元素：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯 • 有机成分 糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。 • 植物生长调节物质： 生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类：6-BA, KT，TDZ，ZT 其他类： GA3, ABA， PP333 • 琼脂、明胶、硅胶等 • 水
• 包扎刀柄，弯嘴镊子； • 写上各组标记； • 交给陈老师，统一灭菌。
2、培养基配制及灭菌（1人/组，12瓶/组）
• MS基本培养基的配制 大量元素 30.0mL 蒸馏水500mL 微量元素 3.0mL 加入搪瓷缸中 + 蔗糖18.0g 铁盐 3.0mL 琼脂4.8g 有机 3.0mL 电磁炉加热煮沸融化琼脂后，加水定容至582mL（用量筒）。 • 加不同激素浓度(0.5、1、2mg/L)MS培养基的配制 取200mL烧杯3个，分别吸取0.1mg/mL 2,4-D溶液 烧杯1: 2,4-D溶液1mL+MS基本培养基194mL 烧杯2: 2,4-D溶液2mL+MS基本培养基194mL 搅拌混匀 烧杯3: 2,4-D溶液4mL+MS基本培养基194mL 用NaOH调pH至5.8,再加水定容至200mL(用量筒)。 • 分装：50mL三角瓶，约20-30mL/瓶，盖上封口膜，用牛皮纸包扎。 • 灭菌：标上激素浓度和姓名，统一放置灭菌。 • 保存：灭菌后，每组带托盘取培养基，放于316培养架上。
三、培养基的配制
1、母液的配制（储备液的配制） 2、培养基的配制
1、储备液配制
MS培养基组成成份 20×储备液1（大量元素） NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 200×储备液2（微量元素） KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 200*储备液3（铁盐） FeSO4.7H2O Na2.EDTA.2H2O 1升储备液用量（mg） 33000 38000 8800 7400 3400 166 1240 4460 1720 50 5 5 5560 7460 20000 100 100 20 400 每升培养基取用量（mL） 50
培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间 容器的体积/mL 在121℃灭菌所 需最少时间/min 20-50 15
75-150
250-500 1000
20
25 30
本节课任务
1、器皿消毒（1人/组）
• 每组包2对培养皿，其中1个培养皿装3张滤纸；
• 包扎2个100mL烧杯，2个250mL三角瓶，每瓶装100mL蒸馏水
3）避免琼脂粘在管口或瓶口
上，最好用漏斗。本实验中， 请借助玻璃棒引流。
• 扎口
•要求封口松紧适宜，系活扣， 便于接种操作。
•本实验中先套封口膜，用橡 皮筋扎好，然后再套上牛皮 纸，用橡皮筋扎好。
• 培养基用湿热灭菌
1）首先取出灭菌桶，向锅内加入适量的水。 2）放回灭菌桶，装入待灭菌物品。 3）加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两 个螺栓。 4）水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全 排尽后，关上排气阀。 5）当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维 持压力至所需时间。本实验用 0.1Mpa，121℃， 20分钟灭菌。 6）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气， 让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0 时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子。 7）将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养24 小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。
5
5
200*储备液4（有机成分） 肌醇 烟酸 盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素 甘氨酸
来自百度文库
5
注意事项
• 一般母液浓度是实验需要浓度的10-200倍。 • 母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、 有机物和激素类等。 • 把几种药品配在同一母液中时，要注意各种化合物的 组合以及加入的前后顺序，应该把钙离子、锰离子、 钡离子与硫酸根和磷酸根例子错开，以免发生沉淀。 把每种试剂单独溶解后再加入后一种化合物。 • 铁盐必须单独配制。将FeSO4.7H2O水溶液缓慢加入到 Na2.EDTA.2H2O微沸水溶液中，并不断搅拌，最后定容。 • 母液配好后放入冰箱内低温保存，用时按比例稀释。
• 激素溶解方法
IAA、IBA、GA NAA 2，4-D 溶于少量的95％的酒精 热水或少量95％的酒精 加水定容； 加水定容；
少量95%的酒精和1M的NaOH溶解 加水定容；
KT和BA
玉米素
溶于少量1M的HCI
溶于少量95％的酒精
加水定容；
加热水定容。
2、培养基的制备
确定配方 取母液
加适量水 培养基熬制 称取蔗糖、琼脂
III.磷盐 KH2PO4 IV. 铁盐 Na2 EDTA Fe SO4 ·7H2O 37.5 27.8 170
V.有机（mg/L）
甘氨酸 盐酸硫胺素 B1 盐酸吡哆醇 B6 烟酸 肌醇
2.0 0.1 0.5 0.5 100
附加成分 ( g/L ) 蔗糖 琼脂 30 8.0
PH = 5.8～6.2
其他物质
定容 调pH值
定
容
接
种
灭
菌
扎
口
分 装
• 培养基熬制及初步定容
1）将培养液倒入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼 脂，边煮边搅拌，防止糊底。注意：火不要太大， 防沸出。 2）用旺火煮开，再用文火加 热，直至琼脂全部融化。
3）取出培养基，并初步定容。
• 调pH值及分装
1）用1M NaOH或HCl调pH 值为5.8。 2）趁热分装，装瓶量一般为 瓶容量的1/3～1/2；装试管一 般为试管高度的1/5～1/4。
常用的MS培养基配方：
I.大量元素（mg/L） NH4NO3 KNO3 CaCl2· 2H2O MgSO4 . 7H2O 1650 1900 440 370
II.微量元素（mg/L）
MnSO4 ·4H2O ZnSO4 ·7H2O H3BO3 KCI Na2MoO4 ·2H2O CuSO4 ·5H2O 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025
第一节 培养基的配置
一、定 义
• 人工配制的
• 微生物或动植物细胞
• 生长繁殖或积累代谢产物
• 营养基质
二、培养基的组成成份
• 无机成分： 大量元素：氮： 铵态氮、硝态氮混合 磷： 磷酸盐 钾： 钾盐 钙、钠、镁、硫 微量元素：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯 • 有机成分 糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。 • 植物生长调节物质： 生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类：6-BA, KT，TDZ，ZT 其他类： GA3, ABA， PP333 • 琼脂、明胶、硅胶等 • 水
• 包扎刀柄，弯嘴镊子； • 写上各组标记； • 交给陈老师，统一灭菌。
2、培养基配制及灭菌（1人/组，12瓶/组）
• MS基本培养基的配制 大量元素 30.0mL 蒸馏水500mL 微量元素 3.0mL 加入搪瓷缸中 + 蔗糖18.0g 铁盐 3.0mL 琼脂4.8g 有机 3.0mL 电磁炉加热煮沸融化琼脂后，加水定容至582mL（用量筒）。 • 加不同激素浓度(0.5、1、2mg/L)MS培养基的配制 取200mL烧杯3个，分别吸取0.1mg/mL 2,4-D溶液 烧杯1: 2,4-D溶液1mL+MS基本培养基194mL 烧杯2: 2,4-D溶液2mL+MS基本培养基194mL 搅拌混匀 烧杯3: 2,4-D溶液4mL+MS基本培养基194mL 用NaOH调pH至5.8,再加水定容至200mL(用量筒)。 • 分装：50mL三角瓶，约20-30mL/瓶，盖上封口膜，用牛皮纸包扎。 • 灭菌：标上激素浓度和姓名，统一放置灭菌。 • 保存：灭菌后，每组带托盘取培养基，放于316培养架上。
三、培养基的配制
1、母液的配制（储备液的配制） 2、培养基的配制
1、储备液配制
MS培养基组成成份 20×储备液1（大量元素） NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 200×储备液2（微量元素） KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 200*储备液3（铁盐） FeSO4.7H2O Na2.EDTA.2H2O 1升储备液用量（mg） 33000 38000 8800 7400 3400 166 1240 4460 1720 50 5 5 5560 7460 20000 100 100 20 400 每升培养基取用量（mL） 50
培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间 容器的体积/mL 在121℃灭菌所 需最少时间/min 20-50 15
75-150
250-500 1000
20
25 30
本节课任务
1、器皿消毒（1人/组）
• 每组包2对培养皿，其中1个培养皿装3张滤纸；
• 包扎2个100mL烧杯，2个250mL三角瓶，每瓶装100mL蒸馏水
3）避免琼脂粘在管口或瓶口
上，最好用漏斗。本实验中， 请借助玻璃棒引流。
• 扎口
•要求封口松紧适宜，系活扣， 便于接种操作。
•本实验中先套封口膜，用橡 皮筋扎好，然后再套上牛皮 纸，用橡皮筋扎好。
• 培养基用湿热灭菌
1）首先取出灭菌桶，向锅内加入适量的水。 2）放回灭菌桶，装入待灭菌物品。 3）加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两 个螺栓。 4）水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全 排尽后，关上排气阀。 5）当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维 持压力至所需时间。本实验用 0.1Mpa，121℃， 20分钟灭菌。 6）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气， 让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0 时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子。 7）将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养24 小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。
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200*储备液4（有机成分） 肌醇 烟酸 盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素 甘氨酸
来自百度文库
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注意事项
• 一般母液浓度是实验需要浓度的10-200倍。 • 母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、 有机物和激素类等。 • 把几种药品配在同一母液中时，要注意各种化合物的 组合以及加入的前后顺序，应该把钙离子、锰离子、 钡离子与硫酸根和磷酸根例子错开，以免发生沉淀。 把每种试剂单独溶解后再加入后一种化合物。 • 铁盐必须单独配制。将FeSO4.7H2O水溶液缓慢加入到 Na2.EDTA.2H2O微沸水溶液中，并不断搅拌，最后定容。 • 母液配好后放入冰箱内低温保存，用时按比例稀释。
• 激素溶解方法
IAA、IBA、GA NAA 2，4-D 溶于少量的95％的酒精 热水或少量95％的酒精 加水定容； 加水定容；
少量95%的酒精和1M的NaOH溶解 加水定容；
KT和BA
玉米素
溶于少量1M的HCI
溶于少量95％的酒精
加水定容；
加热水定容。
2、培养基的制备
确定配方 取母液
加适量水 培养基熬制 称取蔗糖、琼脂
III.磷盐 KH2PO4 IV. 铁盐 Na2 EDTA Fe SO4 ·7H2O 37.5 27.8 170
V.有机（mg/L）
甘氨酸 盐酸硫胺素 B1 盐酸吡哆醇 B6 烟酸 肌醇
2.0 0.1 0.5 0.5 100
附加成分 ( g/L ) 蔗糖 琼脂 30 8.0
PH = 5.8～6.2
其他物质
定容 调pH值
定
容
接
种
灭
菌
扎
口
分 装
• 培养基熬制及初步定容
1）将培养液倒入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼 脂，边煮边搅拌，防止糊底。注意：火不要太大， 防沸出。 2）用旺火煮开，再用文火加 热，直至琼脂全部融化。
3）取出培养基，并初步定容。
• 调pH值及分装
1）用1M NaOH或HCl调pH 值为5.8。 2）趁热分装，装瓶量一般为 瓶容量的1/3～1/2；装试管一 般为试管高度的1/5～1/4。
常用的MS培养基配方：
I.大量元素（mg/L） NH4NO3 KNO3 CaCl2· 2H2O MgSO4 . 7H2O 1650 1900 440 370
II.微量元素（mg/L）
MnSO4 ·4H2O ZnSO4 ·7H2O H3BO3 KCI Na2MoO4 ·2H2O CuSO4 ·5H2O 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025