分子克隆实验步骤总结

分子克隆实验步骤

1.对目的片段进行pcr扩增：

Pcr体系：（50µL）

DNA Template：10-100ng

10×PCR buffer：5µL

50mM dNTPs：0.5µL

Primers：1µM each

Water：add to 49µL

Taq Polymerase：1µL

2.琼脂糖电泳，看有无目的条带

3.对目的条带进行切胶回收

4.对pcr产物加尾: 72℃，20min（如用高保真酶，则需加尾；Taq酶，则无需加尾）

加尾体系：（10µL）

胶回收DNA: 8µL

Buffer: 1µL

dNTPmix: 0.5µL

Taq Polymerase：0.5µL

5.T载体连接：室温，30min

体系：（6µL）

加尾后产物：4µL

T载体：1µL

Salt solution 1µL

6.30-40µL感受态加入重组后的质粒。

7.放冰上30min。

8.42℃热击90s（放冰上冷:1-2min）

9. 加SOC（200-250µL）

10.37℃，300rpm，1h

11.平板涂布：加氨苄的培养基，37℃培养箱倒置培养过夜

12.挑单菌落：用牙签挑单菌落，放到含6mL液体培养基的试管中，

37℃摇床培养过夜

13.试剂盒提质粒

14.酶切：37℃，2h

体系：（20µL）

Buffer2: 2µL

酶：0.5µL

模板：1µL

BSA：0.2µL

H2O：16.31µL

15.琼脂糖凝胶电泳分析是否正确导入目的片段

鉴定阳性克隆的另一个方法----菌落PCR

从平板挑单菌落到含1ml LB（Amp+）的1.5drof管中，37℃摇床培养8小时左右，进行菌落PCR鉴定，引物可选用载体的通用引物，如T载体用M13F/R。

菌落PCR体系（20ul）10*taq buf 2ul

dNTPs（2.5mM）1.6ul Mg2+（25mM）1.6ul Primer F（10uM）0.5ul Primer R（10uM）0.5ul DNA 1 ul Ex taq 0.3 ul

ddH2O 12.5ul

程序：

94度10min

94度30sec

56度30sec

72度2:10 30cycle 72度10min

4度forever