血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳

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实验器材与试剂
• 器材
电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染缸、滤纸、 醋酸纤维素薄膜、点样器
DYY-5型稳压稳流电泳仪
DYY-3型电泳箱
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试剂：
电极缓冲液：巴比妥缓冲液（PH8.5~8.7、 I=0.06）:称取巴比妥2.21g、巴比妥钠 12.36g于500ml蒸馏水中，加热溶解，待冷 却至室温后，用蒸馏水补足至1L。
• 迁移率：是指单位电场强度是离子运动的 速度，也称电泳度。
• 醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维素薄膜
为支持物的电泳。醋酸纤维素是纤维素的
醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。
将醋酸纤维素溶于丙酮等有机溶液中，可
涂布形成均一细密的微孔薄膜，厚度约
0.1~0.15mm。 医学ppt
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• 血清中各种蛋白质的等电点不同，在同一 高于其等电点的PH值缓冲液中，他们都带 负电荷，但电荷数量不同。同时，各种蛋 白质的分子大小不一，所以在同一电场的 电泳迁移率不同。在醋酸纤维素膜上可分 为五条区带。电泳迁移率最大的是白蛋白， 其后依次为α1、 α2、 β和 γ 球蛋白。染色后 经透明处理可直接在光密度计上扫描定量。
• 电泳失败的原因:
①电泳图不完整;②蛋白组分分离不佳；③染色 后蛋白质中间着色浅；④薄膜透明不完全；⑤ 透明膜上有气泡。
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临床意义
• 血清蛋白通过醋酸纤维素薄膜电泳，通常 可以分离得到（Alb）、α 、β 、γ-球蛋白。 正常人血清中各种蛋白组分的浓度差别较 大，所以在许多病理情况系会发生细微的 变化，往往没有特意的临床诊断价值。分 析各种疾病的电泳分析结果，可看出显著 变化。
②
用此法透明的各蛋白质区带鲜明，薄膜平整，
可供直接扫描和永久保存（若用十氢萘或液体石蜡透明，
应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明，此法透明的薄膜不 能久藏，且易发生皱折）。
② 扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他 光密度计暗箱内，进行扫描分析。
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• 计算公式： • 各组分蛋白质%=Ax/At*100 （ Ax:各组分蛋白质的吸光度。 At:各组分蛋白质吸光度的总合。） 各组分蛋白质的绝对浓度（g/L）＝血清总蛋
5. 电泳：将电泳槽正负极与电源正负极接好。开启 电源，调节电流密度为0.5mA/cm,如有10条宽 2cm的膜条，其总宽度为20cm,应使用电流强度为 20cm*0.5mA/cm=10mA。电压15V/cm。通电50 分钟左右，使电泳区带展开3~3.5cm。关闭电源。
6. 染色：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中， 染色5~10min（以蛋白带染透为止），然后在漂 洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止。漂洗 液可回收。
调节血浆pH值,维持酸碱平衡 运输营养物质,代谢物,激素, 药物及金属离子等 免疫作用
4.
这是关键步骤，印章法加样时，动作应
轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出
凹陷而影响电泳区带分离效果。点样前可先在滤
纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。
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4. 平衡：将膜条无光泽面向下置于电泳槽支架上， 点样端靠近负极，薄膜两端要紧贴纱布或滤纸， 中间平直悬空，加盖密封，平衡5分钟。
白（g/L）*各组分蛋白质的百分浓度（％）
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注意事项:
• 每次电泳时应交换电极可使两侧电泳槽内缓冲 溶液的正负离子相互交换，使缓冲液的pH值维 持在一定水平。每使用十次最好将缓冲液弃去。
• 电泳槽两侧的缓冲液面应保持同一水平面，否 则通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分 子的电泳速度
透明液：称取柠檬酸21g和N-甲基-2-吡 咯烷酮150g，以蒸馏水溶解，并稀释 至50ml。亦可选用十氢萘或液体石蜡 透明 （注明各试剂的作用)
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实验操作
1. 准备：将巴比妥缓冲液加入电泳槽的电极室内， 是正负极室的吖液面等高，电泳支架宽度正好 适合醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐 桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。
染色液：氨基黑10B染色液：称取氨基黑 10B0.1g，溶于无水乙醇20ml中，加冰醋酸 5ml、甘油0.5ml，使溶解，然后将磺柳酸 2.5g溶于少量蒸馏水中，加入前液，再以蒸 馏水补足至100ml。
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续：试剂
漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏 水50ml，混匀。适用于氨基黑10B染 色的漂洗。
2. 浸膜：先于膜条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔 轻划一直线（点样线），再将薄膜无光泽面向下 浸泡于巴比妥缓冲液中，浸透为止（约 10~20min）。当膜条无可见的白斑或点状的不 透明区时，取出，将薄膜无光泽面向上，平放 于干净滤纸，薄膜上再放一张干净滤纸轻轻吸 去多余的缓冲液。
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3. 点样:用滴管吸取待测血清一滴于玻璃片上，用点 样器或宽1.5cm的X光软片末端处蘸取少许样品， 垂直轻印（迅速均匀）到薄膜点样线上，使血清 完全渗透到薄膜内，形成一定宽度、粗徐均匀的 直线。（注：点样量不宜过多！）
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7.定量（光密度计扫描法）
① 透明：吸取薄膜上的漂洗液（以防止透明液被稀释影响 透明结果），将薄膜浸入透明液中2~3分钟（延长一些
时间亦无碍）。取出，以滚动方式平贴于洁净无划痕的
载玻片上（勿产生气泡）。将此玻璃片树立片刻，除去 一定量透明液后，置已恒温90~100°C烘箱内烘烤 10~15min，取出冷至室温。
血清蛋白质醋酸纤维素薄膜 电泳
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实验目的
• 掌握电泳的基本原理，了解电泳仪、电泳 槽的基本结构与功能。
• 熟悉电泳的基本过程与定量方法。 • 熟悉血清电泳在临床诊断的作用。
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实验原理
• —PH＜PI时，蛋白质带正电荷，移向负极
– PH＝PI时，蛋白质不带电荷
– PH＞PI时，蛋白质带负电荷，移向正极
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源自文库
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• 血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分, 含量为60～80g/L ,绝大部分由肝脏合 成,仅γ球蛋白由浆细胞合成正常值:
– 白蛋白57%—72%
– α1球蛋白2%—5%
– α2球蛋白4%—9%
– β球蛋白6.5%—12%
– γ球蛋白12%—20%
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• 血浆蛋白的主要功能: 维持血浆胶体渗透压