实验4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)

Y-fitting
tube 2. 共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm， 短的那根长9cm。 将短的那根与Y形管相连， 两根长的则与小套管相连，并连在30ml的注射器上。
Level attachment screw Syringe sleeve
tube
Plunger cap screw
如何确定变性剂（温度）梯度
垂直胶 水平胶
如何确定最佳电泳时间
时间间歇(time travel)
样品前处理
去除单链DNA污染（single-stranded DNA, ssDNA)
优化PCR反应条件和 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（d-PAGE）纯化 1 2 3 4 1 2 3 4 Mung bean nuclease digestion
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁 移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片 段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁 移行为一样，因此不能被区分。 DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加 入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从 而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
SYBR Green I
1. 拨开一块玻璃板，将胶（带着一块玻璃板）放入一 容器中。 2. 取2 ul SYBR Green I，稀释20000倍至20 ml，均匀 涂于胶上。 3. 染色40分钟，紫外灯下照相。
原理
变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪 80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的 点突变。 Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构 研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳 （temperature gradient gel electrophoresis， TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子 生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生 物群落结构的主要分子生物学方法之一。
GC夹子
然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA片段最高的解链区域温 度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在 胶中继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解 链区域时，这些片段就不能被区分开来。 在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（一般30-50个碱 基对），使DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它 的解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE/TGGE胶中完全解 链。当加了GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异 都能被区分开（Myers, 1985).
9. 再将注射器的聚丙烯管同Y形管相连 连接好的灌胶装置如下图所示：
10. 轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的 是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到 三明治式的凝胶板中。灌完后在溶液上方加一层水。 11. 待丙烯酰胺凝固后，将水倒掉。插上梳子，再加入一层无变 性剂的丙烯酰胺溶液。 12. 把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60℃。迅速清洗用 完的设备。 13. 聚合完毕后拔走梳子。用滤纸条将上样孔中的水吸干净。
A
B
染色方法
溴化乙啶（ethidium bromide, EB） SYBR Green I, SYBR Gold 银染法
SYBR Green I
Silver
TGGE设备（Biometra)
丙烯酰胺 APS
TEMED 18 ul 4 ul
变性胶
12.5 ml 80 ul 20 ul
非变性胶 2 ml
core
II. 样品准备
三个样品（太原焦化厂活性污泥样品），已准备好。 1：TJ1-1（第一瀑气池第一时间点） 2：TJ1-3（第一瀑气池第三时间点） 3：TJ2-1（第二瀑气池第一时间点） PCR扩增16S rDNA V3区 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（d-PAGE）纯化去除单链 DNA
5. 配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心 管中 6. 每管加入18 μl TEMED，80 μl 10%APS 迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。 吸入注射器中。 7. 通过推动注射器推动杆小心赶走气泡
8. 分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统 的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确!
GC Clamps on PCR primer
DNA Template
GC Clamp portion of PCR primer
PCR Product with GC clamp incorporated
当用DGGE/TGGE技术来研究微生物群落结构时，要结 合PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用 PCR扩增的16S rRNA产物来反映微生物群落结构组 成。 通常根据16S rRNA基因中比较保守的碱基序列设计通 用引物，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产 物用于DGGE/TGGE分析。 由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片 断，所以一般选择扩增16S rRNA基因的V3区（Muyzer, 1993），或V6-V8区（Zoetendal, 1998）。
实验四 变性梯度凝胶电泳（DGGE）和 温度梯度凝胶电泳（TGGE）
I. 制胶
制胶设备
spacer
clamp
Short glass plate
Larger glass plate
Alignment slot
1. 将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统 垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好 制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。
DGGE 双链DNA 分子变性
TGGE
化学变性剂 温度 （尿素和甲酰胺）
TGGE
DGGE
MD3
MD2
MD1
图1：DNA片段解链区域示意图
DNA片段在D/TGGE胶中的迁移行为
温度 变性剂 low
high
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其 解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。 同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处 达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶 中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下 降，从而在胶中被区分开来。
syringe
3. 在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低ery system
4. 反时针方向旋转凸轮到起始位置。 将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置， 例如16*16cm gels(1mm thick)：设体积调整装置到14.5。
III. 电泳
200V，3.5-5h
IV. 染色（银染法）
1. 拨开一块玻璃板，将胶（带着一块玻璃板）放入一容器中，用 去离子水冲洗（胶和玻璃板脱离）。 2. 将胶转移至固定液（10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸）中，放置 15min。 3. 将胶转移至去离子水中冲洗一次，再转移至银染液（0.2% AgNO3,）中，放置在摇床上摇荡，染色15min。 4. 将胶在去离子水中冲洗1次，转移至显色液（1.5% NaOH, 0.5% 甲醛）中。 5. 待条带出现后，将胶用去离子水冲洗3次，拍照