石蜡切片(固定切染色)步骤

石蜡切片染色

1、 器材
切片刀，切片机，恒温箱，温台，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，展片台，解剖刀，解剖针，解剖剪，解剖盘，培养皿，吸管，镊子，单面刀片，台木，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。
2、 试剂
卡诺氏固定液、FAA固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、埃利希苏木精染液， 1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，郝普特氏粘片剂，中性树胶。1%番红，1%固绿，1%过碘酸，Schiff试剂，0.5%偏重亚硫酸钠溶液，醋酸酐-吡啶混合液，0.5%~1%淀粉糖化酶溶液。
3、 材料
鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。
4、 每个实验小组的用量
(一)器材
切片机，切片刀，温台，恒温箱，熔蜡炉，水浴锅等这类几个小组用一台就行；解剖刀，单面刀片，小台木，毛笔一只，蜡铲一个，盖玻片和载玻片30个，脸盆一个，酒精灯各一个，包埋纸盒2~3个，染色缸一个，瓷杯3个，显微镜一台。
（二）试剂
FAA固定液50ml、1%番红100ml、1%固绿100ml、1%过碘酸100ml、Schiff试剂100ml、亚硫酸盐300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%~1%淀粉糖化酶溶液200ml，石蜡半盒、蜂蜡10块、埃利希苏木精染液100ml、1%伊红酒精溶液100ml、1%盐酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶，甘油蛋白粘片剂数滴，中性树胶数滴。
（三）材料
小白鼠一只、蚕豆种，小麦和大豆种10~20粒，洋葱和大蒜由实验室统一种，然后取其所需部分。
石蜡切片法实例（一）
—苏木精-伊红对染法
一、目的要求
1、 熟悉石蜡切片的制作过程。
2、 掌握HE染色的基本原理和染色方法。
二、实验原理
石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。
三、实验用品
（一） 器材
切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。
（二） 试剂
卡诺（Carnoy）固定液，埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯

，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。
试剂
配法：
1、卡诺氏固定液：
100%酒精3份
冰醋酸 1份
或：100%酒精6份
氯仿 3份
冰醋酸 1份
2、埃利希苏木精染液的配法：
苏木精 1g
纯酒精 50ml
冰醋酸 5 ml
甘油 50 ml
钾矾（硫酸铝钾）约5g（饱和量）
蒸馏水 50 ml
配法：
ⅰ、将苏木精溶于约15 ml的纯酒精中，再加冰醋酸后搅拌。
ⅱ、当苏木精溶解后即将甘油倒入并摇动容器，同时加入其余的酒精。
ⅲ、将钾矾在研钵中研碎并加热，然后将它溶解于水中。
ⅳ、将温热的钾矾溶液一滴一滴地加入上述染液中，并随时搅动。
ⅴ、此液混合完毕，将瓶口用一层纱布包着小块棉花塞起来，放在暗处通风的地方，并经常摇动以促进它的成熟。成熟时间约3~4周。若加入0.2g碘酸钠，可立刻成熟。此液稳定而染色均匀，染核效果良好，不会发生沉淀，长期贮备无妨。此液可分别与伊红等进行二重染色。
3、1%伊红酒精溶液：
伊红1g溶于100 ml95%酒精溶液。
4、1%盐酸乙醇液
盐酸 1份
70%酒精 100份
5、甘油蛋白贴片剂：
蛋白 50 ml
甘油 50 ml
水杨酸钠（防腐剂） 1g
配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。
（三） 材料
鼠肝
三、实验程序
1、 取材
颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或小肠）。切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2~3mm厚。
取材的注意事项：
（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2、固定
将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入卡诺固定液中固定，固定30~50min。
固定的注意事项：
（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。
（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆

。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图
黑墨水书写。
1、 洗涤
材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净，尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，固定液含有乙醇的则用50%~70%乙醇冲洗。
2、 脱水
30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两面三刀次，每次20min。各种材料经固定与洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。
脱水注意事项
（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
（3）在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。
（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象
5、透明
纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明为止），须换一次二甲苯。
由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
透明注意事项
（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。
（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。
（3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。
6、透蜡
放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20~30分钟。
透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以
便包埋。透蜡时间根据组织的透蜡时间较长，约需1~2d。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。置于恒温箱0.5h。
透蜡注意事项
（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；
（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；
（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、

收缩等。
1、 包埋
将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。
用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃，植物材料用的石蜡熔点为54~58℃。
包埋的操作过程
包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。
2、 切片
①将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。
②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。
③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。
④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。
⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4~10微米。
⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40~50r/min。
⑦切成的蜡带到20~30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。
⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。
⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。
3、 贴片
①、取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成
均匀薄层。
②、滴1~2滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。
③、用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。
④、把玻片摆好片位置，在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上（温度保持在40~45℃）。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。
⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。
10、脱蜡复水
石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3~5min，再放入

蒸馏水中3min。
染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相
反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。
11、染色
切片放入苏木精中染色约10~30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。
12、水洗
用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。
13、分化
就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。
14、漂洗
切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。
15、脱水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。
16、复染
用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞
核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。
17、脱水Ⅱ
放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3~5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。
18、透明
切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。
19、封藏：中性树胶封存
切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直

接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本。
封藏的方法：
封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁
净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。
[实验报告]
1、简述石蜡切片的主要过程。
2、分析影响HE染色的主要因素。
石蜡切片法实例（二）
——番红-固绿对染法
一、目的要求
1、 熟悉植物石蜡切片的制作过程。
2、 掌握番红-固绿对染法的基本原理和具体方法。
二、实验原理
石蜡切片法也是在研究植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成连续薄片，切片经染色，观察效果甚好。番红-固绿对染法，为
植物制片上最普遍的一种二重染色法，其染色程序简单并能清晰地显示出细胞的结构。番红为碱性染料，能使细胞核及木质化的细胞壁染成红色；固绿为酸性染料，能使细胞质及纤维素的细胞壁染成绿色。
三、实验用品
（一） 器材
切片刀，切片机，温箱，温台，解剖刀，镊子，单面刀片，台木，毛笔，蜡铲，酒精灯，包埋纸盒，染色缸，玻片盘，温度计，脸盆。
（二）试剂
FAA固定液，1%番红，1%固绿，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，石蜡，郝普特氏明胶粘片剂，树胶。
试剂配法：
1、FAA固定液（福尔马林-醋酸-洒精混合液）
福尔马林 5 ml
50%或70%的洒 90 ml
冰醋酸 5 ml
此液适用于植物组织，此液中的酒精，有用50%的，也有用70%的，一般薄嫩的材料右用50%的，厚硬的材料用70%的，醋酸的用量也可根据材料情况作适当的改变，对一些大块而密实的组织可增加用量，同时减少福尔马林的用量。固定时间可因材料及醋酸含量的变化而异，一般为5~20h。固定的材料，一般无需用水洗，可直接从70%的酒精开始脱水。
1、 1%番红
番红1g溶于100ml水中。
2、 1%固绿
1g固绿溶于100ml95%酒精中。
3、 郝普特氏明胶粘片剂
明胶 1g
蒸馏水 100ml
石炭酸 2g
甘油 15ml
配制时先将明胶溶解于30

℃的蒸馏水中（在水浴锅内进行），待溶解后再加石炭酸和甘油，搅拌均匀后，趁热过滤，贮存于玻璃瓶中。
（三）材料
大豆、小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆等。
三、实验程序
1、 取材
取已培养好的大豆、小麦、蚕豆根或茎、叶等用刀
片将其尖端约1.2cm根尖切割下来，用刀
片切割其成熟区部分成5mm长的小段（亦可切带侧根的部分），将切好的材料放入玻管中。
2、 固定
将FAA固定液倒入盛有材料的玻管中，固定时间为24h。
3、 冲洗
用70%酒精换洗3次，每次0.5-2h。
4、 脱水
80%、90%酒精各1-2h，纯酒精（中间换一次）1-2h。
5、 透明
等量纯酒精及二甲苯中1-2h，二甲苯（中间换一次）1-2h。
6、 透蜡
方法同前。
7、 包埋
方法同前。
8、 切片
根为横切面，其厚度为8~10um。
9、 贴片。
方法同前。
10、 番红-固绿对染法染色程序如下：
（1）切片在二甲苯中脱蜡，约10min。
（2）等量纯酒精二甲苯5min。
（3）经纯酒精，95%、90%、80%、70%、505、305各级酒精各5min。
（4）蒸馏水2-5min。
（5）1%番红水溶液染色2h左右。
（6）用水洗去多余染液。
（7）50%、70%、80%、90%、95%各级酒精脱水10min。
（8）1%的固绿（用95%酒精配制）染色10-40s。
（9）95%酒精洗一下。
（10）纯酒精脱水5min。
（11）等量纯酒精二甲苯混合液中5min。
（12）二甲苯5min。
（13）中性树胶封藏。
注意：
（1）番红与固绿在酒精中很容易脱色，因此在酒精中脱水时，不能放置太久。
（2）用固绿对染之前应检查番红染色的是否合适，所染颜色应稍深一些，以防其在以后脱水步骤中仍会脱色，如果太浅，应退回重染。
[实验报告]
1、 在显微镜下观察根尖的细胞的形态结构，选择典型的根尖细胞绘图。
2、 交植物染色玻片标本2片。