革兰氏染色与显微观察
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实验一:细菌的革兰氏染色与显微镜观察
(一)实验目的
1.了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理
2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。
3. 在油镜下观察细菌几种基本形态
4.掌握细菌革兰氏染色法
(二)实验原理
1.显微镜的基本结构及油镜的工作原理
现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像,故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置最主要包括调焦系统、载物台和物镜转换器等运动部件,以及底座、镜臂和镜筒等支撑部件。光学系统包括不同倍数的物镜、目镜以及由聚光镜和反光镜组成的照明装置。
显微镜的放大倍数=目镜放大倍数*物镜放大倍数
在显微镜的光学系统中,物镜的性能最为关键,它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中,油镜的放大倍数最大,对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比,油镜的使用比较特殊,需在载玻片与镜头之间加滴镜油,这主要有如下二方面的原因:
(1). 增加照明亮度
油镜的放大倍数可达100 Χ,放大倍数这样大的镜头,焦距很短,直径很小,但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线,因介质密度不同(从玻片进入空气,再进入镜头),有些光线会因折射或全反射,不能进入镜头,致使在使用油镜时会因射入的光线较少,物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失,在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率(n=1.55 )相仿的油镜(通常用香柏油,其折射率n=1.5 2)。
(2.)增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率或分辨力(resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看,光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制,分辨力D可表示为:D=λ/2N.A,式中λ= 光波波长;NA= 物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围(0.4--0.7 μ m ),而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率,可表示为:
NA=n × sin α
式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距,一般来说在实际应用中最大只能达到120 O ,而n 为介质折射率。由于香柏油的折射率(1.52 )比空气及水的折射率(分别为1.0 和1.33 )要高,因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值(NA 一般在1.2-1.4)要高于低倍镜、高倍镜等干镜(NA 都低于1.0)。若以可见光的平均波长0.55 μm来计算,数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体,而油镜的分辨率却可达到0.2 μ m 左右。
2.革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法所以能将细菌分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上,当用结晶紫初染后,像简单染色法一样,所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂,它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物,从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,壁厚、类脂质含量低,用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高,所以当脱色处理时,类脂质被乙醇(或丙酮)溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。
(二)实验器材
1.菌种
枯草芽孢杆菌12~18h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物
2.溶液或试剂
香柏油,结晶紫染色液、卢戈碘液、95%乙醇、番红染色液,蒸馏水
3.仪器及相关用品
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、镊子
(三)实验方法
1.显微观察
显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序。
油镜观察摆好显微镜,接通电源,调节好照明亮度,低倍镜下找到要观察的样品区域后,用粗调节器将镜筒升高,然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油,从侧面注视,用粗调节器将镜筒小心地降下,使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈,若所用聚光器的数值孔径值超过1.0 ,还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油,保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适,用粗调节器将镜筒徐徐上升,直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。
2.革兰氏染色
(2)初染
滴加结晶紫(以覆盖细菌涂面为准)于玻片的涂面上,染色1~2min ,倾去染色液,水洗:倾去滤液,用自来水冲洗,直到涂片上留下的水无色为止。(水洗时,不要直接冲洗液面,而应使水从载玻片的一端流下水流不宜过急过大,以免涂片薄膜脱落。)
干燥:自然干燥或电吹风吹干,也可用吸水纸吸干。
(3)媒染
滴加碘液冲去残水,并覆盖约1 min ,水洗。
(4)脱色
将在玻片上的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色为止,一般要用时20——30s,立即用水冲净酒精。
注意:革兰氏染色结果是否正确,乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足,阴性菌被误染成阳性菌,脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20~30s。(5)复染
用番红染液1——2min,水洗。
(6)镜检
干燥后,用油镜观察。革兰氏阳性细菌呈蓝紫色;革兰氏阴性细菌呈红色。以分散开的细菌的革兰氏染色反映为准,过于密集的细菌,常呈现假阳性。
4.用毕后的处理
(1)上升镜筒,取下载玻片。
(2)用擦镜纸拭去镜头上的镜油,然后用擦镜纸蘸少许二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去镜头上残留的油迹,最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
(3)分还原,反光镜垂直于镜座,将物镜转成“八”字形,再向下旋。同时把聚光镜降下,以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
(四)实验结果
1.绘出你在油镜下观察到的三种菌的形态
1、用油镜观察时应注意哪些问题?在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用?
答:(1)应该先用低倍镜找到样品区域,再转换高倍镜,在转换时要注意不要转错方向;油镜只可以在100倍或者标有oil的物镜才可以使用;在转换过程中不要调节粗准焦螺旋;在观察中亮度要调到最亮,否则视野会不够亮。
(2)滴加的油是香柏油
(3)作用主要有两个方面:一、增加照明亮度。二、增加显微镜的分辨率。
2、影响显微镜分辨率的因素有哪些?
答:物镜性能(直径和焦距等),目镜,透光率,光线亮度等。
3、为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作?
答:在使用高倍镜时,物镜离载物台很近,而粗调节器上升下降的速度很快,调节有误就会撞坏物镜。
4、为什么要求涂片完全干燥后才能用油镜观察?制备细菌染色标本时,应该注意哪些环节?