叶酸代谢能力基因检测操作流程

MTHFR C677T , MTHFR A1298C, MTRR A66G基因检测操作流程实验流程

一、操作步骤

适用仪器：普通PCR仪

样本要求：EDTA抗凝剂的静脉全血（100µl），室温保存不超过7天，2～8℃保存不超过1个月，-20℃保存不超过3个月，反复冻融次数不超过5次；DNA的浓度应不低于5ng/μl，A260/ A 280应在1.6~2.0之间。有血块的样本需经匀浆处理或用组织研磨仪研磨处理后再进行全血DNA的提取。

检验方法：（试剂盒中的检本测卡、阳性/阴性对照卡上标识解释如下：M表示突变型，WT表示

野生型，C表示质控线，T表示检测线。）

A：样本DNA的制备

试剂盒准备工作：

1、清洗液BW-I：用50 ml量筒分别移取35 ml无水乙醇（分析纯）和35 ml异丙醇加入至清洗液BW-I试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。

2、清洗液BW-II：用50 ml量筒移取49 ml无水乙醇加入至清洗液BW-II试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。

3、蛋白酶K准备：取出蛋白酶K，室温解冻，涡旋混匀后备用。

4、磁性微粒准备：将磁性微粒涡旋混匀，保证均一。

实验操作步骤：

1.将20 μl蛋白酶K溶液加入2 ml 离心管的管底。依次加入100 μl全血、200 μl裂解液

BL，用涡旋振荡器混合15 sec(以下简称涡旋混匀)，56 ℃水浴20 min。

2.向步骤1裂解处理的样品中依次加入300 μl结合液BI、25 μl的磁性微粒（移取前必须充

分涡旋混匀），涡旋混匀，室温静置5 min。磁性分离5 min，弃上清。

3.从磁性分离器上取出离心管，加入400 μl清洗液BW-I，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期

间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清；重复本步操作，以400μl清洗液BW-I重复清洗一次。

4.从磁性分离器上取出离心管，加入400 μl清洗液BW-II，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期

间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清（尽可能弃去所有的清洗液BW-II）。

5.打开离心管盖，将其室温晾干5 min。

6.从磁性分离器上取下离心管，向管中加入100 μl 洗脱液ES，涡旋混匀，56℃水浴5 min。

7.将离心管置于磁性分离器上，磁性分离至上清澄清。将上清液（分离纯化得到的DNA溶液）

转移到2 ml离心管中，直接用于下游实验或于-20 ℃保存备用。

B：PCR扩增液准备

（1）每人份需做两个反应，取两个无菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT。

（2）将试剂从-20℃取出平衡至室温，瞬时离心。在标有M的管中加入29µl 扩增液（M），在标

有WT的管中加入29 µl扩增液（WT）。

（3）分别向以上M和WT各管中加入1µl反应液。将管盖盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心待用。C：待检测DNA样本的配制

在上述标有M、WT管中分别加入3µl待测基因组DNA，分别再加入17µl ddH2O使终体积为50 µl。将管盖盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心。

D：PCR扩增

将PCR管放入PCR仪中，按如下程序扩增：50℃ 2min；95℃ 5min；94℃ 30sec、60℃ 30sec、65℃ 1min（26Cycles）；65℃ 10min；4℃ Hold。取出PCR产物，2~8℃保存。

E：检测卡检测实验

从密封袋中取出检测卡，将待测样本M与WT管中的PCR产物分别滴加在检测卡对应的样品垫处，待2~5 min对结果进行判读，20min后结果不可靠。

F：质量控制

（1）检测结果中阳性对照应在阳性对照卡检测线（T线）出条带，阴性对照应在阴性对照卡检测线（T线）不出条带。正常检测时，应定期进行阳性对照品及阴性对照品实验。

（2）阳性对照品实验：取两个无菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT，将20µl M阳性对照液、20µl WT阳性对照液分别加入标有M、WT的PCR薄壁管中，再依次分别加入M扩增液29µl及1µl反应液、WT扩增液29µl及1µl反应液，按照步骤中D~F完成，检测线（T线）及质控线（C线）均应出现条带。

（3）阴性对照品实验：取两个无菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT，将M扩增液29µl、1µl反应液及WT扩增液29µl、1µl反应液分别加入标有M、WT的PCR薄壁管中，再分别加入20µl阴性对照液，按照步骤中D~F完成，质控线（C线）应出现条带，检测线（T线）应无条带出现。

G：结果判读（如下图、下表）

如上图一所示，以阳性对照液为模板进行PCR反应，对PCR产物进行检测，检测线（T线）有

条带出现，作为阳性对照；以阴性对照液为模板进行PCR 反应，对PCR 产物进行检测，检测线（T 线）无条带出现，为阴性对照。若阴性样本有条带出现，有可能加样时未及时更换吸头，有DNA 污染，建议在操作过程中，先配制阴性对照管并及时闭合PCR 管盖。图二显示MTHFR 677CC 表示正常野生型；图三显示MTHFR 677TT 表示一对等位基因的第677位胞嘧啶（C ）均变为胸腺嘧啶（T ），即纯合突变；图四显示MTHFR 677CT 表示其中一个等位基因的第677位胞嘧啶（C ）变为胸腺嘧啶（T ），即杂合突变；图五质控线（C 线）无条带或质控线（C 线）与检测线（T 线）均无条带，即为无效检测。无效原因可能为操作不正确或试纸条已变质损坏。应再次仔细阅读说明书，并用新的检测卡重新检测。如果问题仍然存在，应立即停止使用该批号产品，并与厂家或供应商联系。

H ：注意事项

（1）实验室应该遵循PCR 实验规范的要求分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用，加模板和引物的移液器不能混用，每次加样后均需更换吸头，推荐使用无核酶、带滤芯的吸头。各区的仪器、设备和工作服应独立使用。

（2）本试剂盒用于体外操作。用户切勿吸入试剂或直接接触皮肤。

（3）使用本试剂盒前，请仔细阅读说明书，严格按照说明书的要求操作。打开包装后请尽快使用。

（4）使用本试剂盒时，因PCR 体系为50µl 体系，应使用200µl 的PCR 扩增管进行操作。

（5）本试剂盒备有“PCR 组分加入确认单”，在【检测方法】中的步骤B(PCR 扩增系统的准备)和C(待图二 野生型 图三 纯合突变 图一 阳性及阴性对照 图五 无效图

图四 杂合突变